范围:本文件规定了水源水、生活饮用水及矿泉水、饮用纯净水等包装饮用水的水质中的菌落总数、大肠菌群、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌等微生物检测的基本原则和要求、检测方法。 本文件适用于水质中菌落总数、大肠菌群、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌的定性和定量测定; 主要技术内容:5　试验方法菌落总数测定5.1.1　原理在37℃培养24 h后，水样中的微生物通过新陈代谢产生酸碱度的变化，使菌落总数检测试剂中的酸碱指示剂发生颜色变化，该颜色变化可以被肉眼捕捉，也可以被光电检测仪的信号源捕捉，进而完成测定。5.1.2　仪器和设备冰箱:2 ℃～5 ℃。涡旋振荡器。无菌吸管:1mL(具0.01 mL 刻度)、5 mL(具0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。恒温培养箱:36 ℃±1 ℃。微生物光电检测系统（如FORBID-M光电检测仪）。光电检测管（如FORBID-M光电检测管）。5.1.3　培养基和试剂菌落总数快速检测试剂:见附录 2.1菌落总数质控菌株：大肠埃希氏菌 CICC 10389、金黄色葡萄球菌 ATCC 25923、铜绿假单胞菌 ATCC 9027。5.1.4　 检验程序菌落总数的检验程序见图1。图 1 菌落总数检验程序5.1.5　操作步骤培养基准备使用一次性无菌吸管或微量移液器及吸头吸取菌落总数快速检测试剂加入光电检测管中，5 mL/管。样品的接种使用一次性无菌吸管吸取1mL混匀后的样品，注入已加好菌落总数快速检测试剂的光电检测管中并做好标记。其中1支检测管不加检测样品作为空白对照。标准曲线的建立5.1.5.3.1　如需定量时，以灭菌处理后的无菌样品做为稀释基质，使用涡旋振荡器对菌落总数质控菌株进行十倍梯度稀释，选择5-7个适宜的稀释梯度，按照5.1.5.1-5.1.5.4中的操作步骤使用微生物光电检测系统进行检测，同时按照GB 4789.2中的营养琼脂平板法进行培养。5.1.5.3.2　以仪器拟合拐点时间（h）为横坐标，平板计数结果对数值（log C）为纵坐标建立线性相关标准曲线，若线性相关系数满足 R2 ≥ 0.98时 ，即可将命名为菌落总数的标准曲线写入仪器，反之则需重新建立标准曲线。5.1.5.3.3　若无需对结果定量时，则直接跳过5.1.5.3标准曲线的建立步骤。培养5.1.5.4.1　人工定性检测：将光电检测管放入36℃±1℃恒温培养箱培养12-24h。5.1.5.4.2　自动定性检测：将光电检测管放入光电检测仪中，并设置程序后开始检测：菌落总数，24 h。5.1.5.4.3　定量检测：将光电检测管放入光电检测仪中，选择菌落总数标准曲线，设置程序后开始检测：菌落总数，24 h。结果判定及表述5.1.5.5.1　人工定性检测：培养至12h-24h时观察光电检测管中是否产生颜色变化。与空白对照相比，若检测管明显浑浊或变黄即视为菌落总数阳性，即“每1 mL水中检出菌落总数”；若检测管未产生浑浊或变黄即视为菌落总数阴性，即“每1 mL水中未检出菌落总数”。5.1.5.5.2　自动定性检测：程序运行结束后会自动生成检测报告。若检测报告显示菌落总数 >1 CFU/mL即视为菌落总数阳性，即“每1 mL水中检出菌落总数”；若检测报告显示菌落总数 <1 CFU/mL即视为菌落总数阴性，即“每1 mL水中未检出菌落总数”。5.1.5.5.3　定量检测：程序运行结束后自动生成检测报告。若菌落总数为阳性，则会在检测报告上显示菌落总数的具体数值；若菌落总数为阴性，则会在检测报告显示菌落总数 <1 CFU/mL。大肠菌群测定5.2.1　原理在37℃下培养24h，大肠菌群能产生β-半乳糖苷酶( β-D-galactosidase )，将大肠菌群检测试剂中的邻硝基苯β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）分解为黄色的邻硝基苯酚（ONP），该颜色变化可以被肉眼捕捉，也可以被光电检测仪的信号源捕捉，进而完成测定。5.2.2　仪器和设备冰箱:2 ℃～5 ℃。涡旋振荡器。无菌吸管:1 mL(具0.01 mL 刻度)、5 mL(具0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。恒温培养箱:36 ℃±1 ℃。微生物光电检测系统（如FORBID-M光电检测仪）。光电检测管（如FORBID-M光电检测管）。六联过滤器。气液两用真空泵。5.2.3　 培养基和试剂大肠菌群快速检测试剂：见附录 2.2。大肠菌群质控菌株：大肠埃希氏菌 CICC 10389、阴沟肠杆菌 ATCC 13047、弗氏柠檬酸杆菌 ATCC 43864。5.2.4　检验程序大肠菌群的检验程序见图2。图 2 大肠菌群检验程序5.2.5　操作步骤培养基准备使用一次性无菌吸管或微量移液器及吸头吸取大肠菌群快速检测试剂加入光电检测管中，5 mL/管。样品的接种在无菌环境下进行过滤操作。首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将100mL水样通过孔径0.45μm的滤膜过滤。将过滤后的滤膜（折叠）放入已加好大肠菌群快速检测试剂的光电检测管中并做好标记。其中1支检测管不加检测样品作为空白对照。标准曲线的建立5.2.5.3.1　如需定量时，以灭菌处理后的无菌样品做为稀释基质，使用涡旋振荡器对大肠菌群质控菌株进行十倍梯度稀释，选择5-7个适宜的稀释梯度，按照5.2.5.1-5.2.5.4中的操作步骤使用微生物光电检测系统进行检测，同时使用无选择性的LB平板培养法进行培养。5.2.5.3.2　得出结果后，以仪器拟合拐点时间（h）为横坐标，平板计数结果对数值（log C）为纵坐标建立线性相关标准曲线，若线性相关系数满足 R2 ≥ 0.98 时，即可将命名为大肠菌群的标准曲线写入仪器，反之则需重新建立标准曲线。5.2.5.3.3　若无需对结果定量时，则直接跳过5.2.5.3标准曲线的建立步骤。培养5.2.5.4.1　人工定性检测：将光电检测管放入36℃±1℃恒温培养箱培养12-24h。5.2.5.4.2　自动定性检测：将光电检测管放入光电检测仪中，并设置程序后开始检测：大肠菌群，24 h。5.2.5.4.3　定量检测：将光电检测管放入光电检测仪中，选择大肠菌群标准曲线，设置程序后开始检测：大肠菌群，24h。结果判定及表述5.2.5.5.1　人工定性检测：培养至12h-24h时观察光电检测管中是否产生颜色变化。与空白对照相比，若检测管明显浑浊或变黄即视为大肠菌群阳性，即“每1 mL水中检出大肠菌群”；若检测管未产生浑浊或变黄即视为大肠菌群阴性，即“每1 mL水中未检出大肠菌群”。5.2.5.5.2　自动定性检测：程序运行结束后会自动生成检测报告。若检测报告显示大肠菌群 >1 CFU/mL即视为大肠菌群阳性，即“每1 mL水中检出大肠菌群”；若检测报告显示大肠菌群 <1 CFU/mL即视为大肠菌群阴性，即“每1 mL水中未检出大肠菌群”。5.2.5.5.3　定量检测：程序运行结束后自动生成检测报告。若大肠菌群为阳性，则会在检测报告上显示大肠菌群的具体数值；若大肠菌群为阴性，则会在检测报告显示大肠菌群 <1 CFU/mL。大肠埃希氏菌测定5.3.1　原理在37℃培养24h，大肠埃希氏菌能产生β-葡萄糖醛酸酶(β-Glucuronidase)，将大肠埃希氏菌快速检测试剂中的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)分解为4-甲基伞形酮，在365 nm紫外灯照射下产生蓝白色荧光。5.3.2　仪器和设备冰箱:2℃～5℃。涡旋振荡器。无菌吸管:1 mL(具0.01 mL 刻度)、5 mL(具0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。恒温培养箱:36℃±1℃。微生物光电检测系统（如FORBID-M光电检测仪）。光电检测管（如FORBID-M光电检测管）。365 nm 紫外光源。六联过滤器。气液两用真空泵。5.3.3　培养基和试剂大肠埃希氏菌快速检测试剂:见附录 2.3。大肠埃希氏菌质控菌株：大肠埃希氏菌 CICC 10389。5.3.4　检验程序大肠埃希氏菌的检验程序见图3。图 3 大肠埃希氏菌检验程序5.3.5　操作步骤培养基准备使用一次性无菌吸管或微量移液器及吸头吸取大肠埃希氏菌快速检测试剂加入光电检测管中，5 mL/管。样品的接种在无菌环境下进行过滤操作。首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分,将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将100mL水样或稀释液通过孔径0.45μm的滤膜过滤。将过滤后的滤膜（折叠）放入已加好大肠埃希氏菌快速检测试剂的光电检测管中并做好标记。其中1支检测管不加检测样品作为空白对照。标准曲线的建立5.3.5.3.1　如需定量时，以灭菌处理后的无菌样品做为稀释基质，使用涡旋振荡器对大肠埃希氏菌质控菌株进行十倍梯度稀释，选择5-7个适宜的稀释梯度，按照5.3.5.1-5.3.5.4中的操作步骤使用微生物光电检测系统进行检测，同时使用无选择性的LB平板培养法进行培养。5.3.5.3.2　得出结果后，以仪器拟合拐点时间（h）为横坐标，平板计数结果对数值（log C）为纵坐标建立线性相关标准曲线，若线性相关系数满足 R2 ≥ 0.98 时，即可将命名为大肠埃希氏菌的标准曲线写入仪器，反之则需重新建立标准曲线。5.3.5.3.3　若无需对结果定量时，则直接跳过5.3.5.1标准曲线的建立步骤。培养5.3.5.4.1　人工定性检测：将光电检测管放入36℃±1℃恒温培养箱培养12-24h。5.3.5.4.2　自动定性检测：将光电检测管放入光电检测仪中，并设置程序后开始检测：大肠埃希氏菌，24 h。5.3.5.4.3　定量检测：将光电检测管放入光电检测仪中，选择大肠埃希氏菌标准曲线，设置程序后开始检测：大肠埃希氏菌，24 h。结果判定及表述5.3.5.5.1　人工定性检测：培养至12h-24h时使用365 nm紫外光源观察光电检测管中是否有蓝白色荧光产生。与空白对照相比，若被检样品产生明显的蓝白色荧光即视为大肠埃希氏菌阳性，即“每100mL水中检出大肠埃希氏菌”；若被检样品未产生蓝白色荧光即视为大肠埃希氏菌阴性，即“每100 mL水中未检出大肠埃希氏菌”。5.3.5.5.2　自动定性检测：程序运行结束后会自动生成检测报告。若检测报告显示大肠埃希氏菌 >1 CFU/100mL即视为大肠埃希氏菌阳性，即“每100 mL水中检出大肠埃希氏菌”；若检测报告显示大肠埃希氏菌 <1 CFU/100mL即视为大肠埃希氏菌阴性，即“每100 mL水中未检出大肠埃希氏菌”。5.3.5.5.3　定量检测：程序运行结束后自动生成检测报告。若大肠埃希氏菌为阳性，则会在检测报告上显示大肠埃希氏菌的具体数值；若大肠埃希氏菌为阴性，则会在检测报告显示大肠埃希氏菌 <1 CFU/100mL。铜绿假单胞菌测定5.4.1　原理在37℃下培养30h，铜绿假单胞菌能产生β-丙氨酰氨肽酶，将选择性培养基中的探针L-丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素三氟乙酸盐（H-Ala-AMC-TFA）分解为4-甲基伞形酮，在365 nm紫外灯照射下产生荧光。5.4.2　仪器和设备冰箱:2 ℃～5 ℃。涡旋振荡器。无菌吸管:1 mL(具0.01 mL 刻度)、5 mL(具0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。恒温培养箱:36 ℃±1 ℃。微生物光电检测系统（如FORBID-M光电检测仪）。光电检测管（如FORBID-M光电检测管）。365 nm 紫外光源。气液两用真空泵。5.4.3　培养基和试剂铜绿假单胞菌快速检测试剂:见附录 2.4。铜绿假单胞菌质控菌株：铜绿假单胞菌 ATCC 9027。5.4.4　检验程序铜绿假单胞菌的检验程序见图4。图 4 铜绿假单胞菌检验程序5.4.5　操作步骤培养基准备使用一次性无菌吸管或微量移液器及吸头吸取铜绿假单胞菌快速检测试剂加入光电检测管中，5 mL/管。样品的接种在无菌环境下进行过滤操作。首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将250mL水样或稀释液通过孔径0.45μm的滤膜过滤。将过滤后的滤膜（折叠）放入已加好铜绿假单胞菌快速检测试剂的光电检测管中并做好标记。其中1支检测管不加检测样品作为空白对照。标准曲线的建立5.4.5.3.1　如需定量时，以灭菌处理后的无菌样品做为稀释基质，使用涡旋振荡器对铜绿假单胞菌质控菌株进行十倍梯度稀释，选择5-7个适宜的稀释梯度，按照5.4.5.1-5.4.5.4中的操作步骤使用光电检测仪进行检测，同时使用无选择性的LB平板培养法进行培养。5.4.5.3.2　得出结果后，以仪器拟合拐点时间（h）为横坐标，平板计数结果对数值（log C）为纵坐标建立线性相关标准曲线，若线性相关系数满足 R2 ≥ 0.98 时，即可将命名为铜绿假单胞菌的标准曲线写入仪器，反之则需重新建立标准曲线。5.4.5.3.3　若无需对结果定量时，则直接跳过5.4.5.1标准曲线的建立步骤。培养5.4.5.4.1　人工定性检测：将光电检测管放入36℃±1℃恒温培养箱培养17-30h。5.4.5.4.2　自动定性检测：将光电检测管放入光电检测仪中，并设置程序：铜绿假单胞菌，30h。5.4.5.4.3　定量检测：将光电检测管放入光电检测仪中，选择铜绿假单胞菌标准曲线，设置程序后开始检测：铜绿假单胞菌，30h。结果判定及表述5.4.5.5.1　人工定性检测：培养至17h-30h时使用365 nm紫外光源观察光电检测管中是否有蓝白色荧光产生。与空白对照相比，若被检样品产生明显的蓝白色荧光即视为铜绿假单胞菌阳性，即“每250mL水中检出铜绿假单胞菌”；若被检样品测试孔未产生蓝白色荧光即视为铜绿假单胞菌阴性，即“每250mL水中未检出铜绿假单胞菌”。5.4.5.5.2　自动定性检测：程序运行结束后会自动生成检测报告。若检测报告显示铜绿假单胞菌 >1 CFU/250mL即视为铜绿假单胞菌阳性，即“每250mL水中检出铜绿假单胞菌”；若检测报告显示铜绿假单胞菌 <1 CFU/250mL即视为铜绿假单胞菌阴性，即“每250mL水中未检出铜绿假单胞菌”。5.4.5.5.3　定量检测：程序运行结束后会自动生成检测报告。若铜绿假单胞菌为阳性，则会在检测报告上显示铜绿假单胞菌的具体数值；若铜绿假单胞菌为阴性，则会在检测报告显示铜绿假单胞菌 <1 CFU/250mL