主要技术内容:动物性食品中 12 种β-受体激动剂类药物检测技术规范 酶联免疫吸附法 1 范围本文件规定了酶联免疫吸附法（ELISA）检测动物性食品中12种β-受体激动剂类药物残留量的 技术规范。 本文件适用于猪肉、牛肉、羊肉中克伦特罗、沙丁胺醇、氯丙那林、特布他林、妥布特罗、溴 布特罗、马喷特罗、西布特罗、马布特罗、班布特罗、西马特罗和非诺特罗等 12 种β-受体激动剂 类药物总残留量的测定。 本文件方法的最低检测限：猪肉、牛肉、羊肉中 12 种β-受体激动剂类药物总残留量的最低检 测限均为 1μg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用 文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 33411 酶联免疫分析试剂盒通则 3 原理采用间接竞争 ELISA 方法，在微孔条上包被克伦特罗抗原，试样中残留的β-受体激动剂类药物 与酶标板上的克伦特罗抗原竞争克仑特罗抗体，加酶标记的抗体后，显色剂显色，终止液终止反应。 用酶标仪在 450 nm 处测定吸光度,吸光值与 12 种β-受体激动剂类药物残留总量成负相关，与标准 曲线比较即可得出 12 种β-受体激动剂类药物残留量。T/SDAA 0054－2021 4 试剂或材料 以下所用的试剂，除非另有规定外，仅使用分析纯试剂 4.1 水，GB/T 6682，三级。 4.2 氢氧化钠（NaOH） 4.3 三氯乙酸（C2HCl3O2） 4.4 氢氧化钠溶液：C(NaOH)= 1 mol/L，称取氢氧化钠（4.2）40.0 g，加水溶解定容至 1000 mL。 4.5 三氯乙酸溶液：C(C2HCl3O2)=10 g/L，称取三氯乙酸（4.3）10.0 g，加 1000 mL 水溶解，摇匀。 4.6 β-受体激动剂检测试剂盒 2℃～8℃保存。 4.6.1 包被有克仑特罗抗原的 96 孔板 规格为 12 条×8 孔。 4.6.2 克仑特罗抗体工作液 4.6.3 酶标记物工作液 4.6.4 20 倍浓缩洗涤液 4.6.5 底物液 A 液 4.6.6 底物液 B 液 4.6.7 终止液 4.6.8 克仑特罗系列标准溶液 6 个浓度梯度，浓度分别为 0μg/L、0.2μg/L、0.6μg/L、1.8μg/L、5.4μg/L、16.2μg/L。 4.6.9 洗涤工作液 用水将 20 倍的浓缩洗涤液按 1:19 体积比进行稀释（1 份 20 倍浓缩洗涤液+19 份水），用于酶 标板的洗涤。2℃～8℃保存，有效期 1 个月。 4.6.10 底物液 A、B 混合液 底物液 A 液、底物液 B 液按体积 1:1 充分混匀，混合液在 5 min 内使用，避免使用金属盛装、 搅拌混合液。 5 仪器设备 5.1 酶标仪 配备 450 nm 滤光片。 5.2 微量移液器 单道 20 μL～200 μL、200 μL～1000 μL 微量移液器，8 道 50 μL～300 μL 微量移液器。 5.3 均质器 转速 10000 r/min～15000 r/min。T/SDAA 0054－2021 5.4 微量振荡器 适用 96 孔板。 5.5 旋涡混合器 5.6 天平 感量为 0.01 g。 5.7 离心机 转速≥4000 r/min。 6 试样制备 样品保存在-20℃冰箱中。 取新鲜或解冻的空白样品，剪碎，置于均质器中以 10000 r/min～15000 r/min 高速均质 1min。 7 分析步骤 7.1 样品处理 称取试样 2 g±0.01 g 于 50 mL 离心管中，加入 4 mL 三氯乙酸溶液（4.5），充分混匀；4000 r/min 离心 5 min；取 1 mL 上清液于新的离心管中，加入 30 μL 氢氧化钠溶液（4.4），涡动 10 s 混匀； 4000 r/min 离心 5 min；取 50 μL 上清液进行检测。稀释倍数为 2 倍。 7.2 测定步骤 使用前将试剂盒置于室温（19 ℃～25 ℃）下放置 1 h～2 h。 7.2.1 按每个标准溶液和试样溶液分别至少做两份平行试验计算，将所需数目的酶标板条插入板架 中，记录各标准溶液和试液的位置。 7.2.2 加 50 μL 各标准溶液（4.6.8）或试样溶液到各自微孔中。 7.2.2 加入 50 μL 抗体工作液（4.6.2）到每一微孔中，充分混匀，室温下（25℃±2℃）避光反 应 15 min。 7.2.3 倒掉孔中液体，每孔加入 260 μL 洗涤工作液（4.6.9），充分洗涤 4 次，每次浸泡 15 s～30 s。7.2.4 倒掉板孔中液体，将酶标板倒置于吸水纸上，拍干；立即在每孔中加入 100 μL 酶标记物工 作液（4.6.3），充分混匀，室温下（25℃±2℃）避光反应 15 min。 7.2.5 重复步骤 7.2.3； 7.2.6 立即在每孔中加入 100 μL 底物 A、B 混合液（4.6.10），充分混匀，室温下（25℃±2 ℃） 避光反应 15 min～20 min。 7.2.7 每孔中加入 50 μL 终止液（4.6.7），充分混匀；终止后 5 min 内用酶标仪在波长 450 nm 处 测定吸光度。T/SDAA 0054－2021 7.3 空白试验 取试剂盒中提供的空白，按 7.2 测定步骤进行。 7.4 质控试验 每次测定均应做 1 个用空白试样添加标准溶液的质控样品。 8 结果计算和表述 8.1 相对吸光度值 用标准溶液和试样溶液吸光度值与空白溶液吸光度值的比值进行计算，见式（1）： Ar = BB0×100% …………………（1） 式中： Ar —相对吸光度值，%； B —标准（或试样）溶液的平均吸光度值； B0—空白的平均吸光度值。 计算结果保留 3 位有效数字。 8.2 绘制标准曲线 以相对吸光度值（%）为纵坐标，以各标准溶液浓度（μg/L）的自然对数为横坐标，在半对数 坐标上绘制标准曲线。每次试验均需新绘制标准曲线。 8.3 样品结果计算 样品中β-受体激动剂类药物残留总量以 X 表示，数值以微克每千克（μg/kg）表示，按式（2） 计算：X = C × n …………（2） 式中： C—从标准曲线上查德的试样溶液中的药物浓度，单位为微克每升（μg/L）； n—试样稀释倍数。 计算结果保留三位有效数字。T/SDAA 0054－2021 9. 交叉反应 克仑特罗：100%。 氯丙那林：141% 妥布特罗：80% 溴布特罗、马喷特罗：107% 西布特罗：86.9%。 沙丁胺醇：60.6%。 马布特罗：56.3%。 特布他林：33.1%。 班布特罗：18%。 西马特罗：14%。 非诺特罗：10.6%。 10. 精密度 10.1 灵敏度 本方法在猪肉、牛肉、羊肉样品中β-受体激动剂类药物残留总量的检测限均为 1 μg/kg。 10.2 准确度 本方法在 1 μg/kg～10μg/kg 添加浓度水平上回收率均为 60%～120%。 10.3 准确度 本方法的批内变异系数≤20%，批间变异系数≤30%