范围:本文件规定了方法原理、检测条件、试剂材料和仪器设备、检测流程、样本制备、样本检测、测定结果有效性判定、测定结果和注意事项。 本文件适用于外周血液循环肿瘤细胞的非抗体依赖磁分离检测; 主要技术内容:4 方法原理4.1 基于 CTC 和血球细胞之间的特性差异，利用非抗体依赖的方法捕获 CTC 并通过细胞染色、免疫细胞化学、荧光原位杂交或逆转录聚合酶链式反应法对捕获细胞进行分析鉴定。4.2 非抗体依赖的方法包括无标记捕获探针法（见 9.2.1）、多肽捕获探针法（见 9.2.2）、膜过滤法（见附录 C）和微流控芯片法（见附录 D）等。非抗体依赖磁分离方法包括但不限于以下两种：——无标记捕获探针法：CTC 在一定密度梯度介质中通过离心力进行分层分离后，利用无标记的顺磁性纳米磁性微粒捕获CTC，并在外加磁场的作用下实现CTC与其他血液成分有效分离和富集；——多肽捕获探针法：利用多肽修饰的磁性微粒捕获外周血中的 CTC，多肽捕获探针与外周血中的CTC 稳定结合，并在外加磁场的作用下实现 CTC 与其他血液成分有效分离和富集。5 检测条件检测条件如下：——温度：25 ℃±5 ℃；——相对湿度：30％～65％；——压强：标准大气压。6 试剂材料和仪器设备试剂材料和仪器设备应符合附录A的要求。7 检测流程7.1 外周血中 CTC 检测流程见图 1。7.2 CTC 磁分离检测操作见附录 B。8 样本制备8.1 血液样本采集8.1.1 采血前准备肝素/EDTA-K2 真空抗凝管。8.1.2 采血量宜为 4 mL～15 mL，采血收集完毕后，应立即颠倒混匀采血管不少于 5 次，不宜剧烈震荡，产生气泡。8.1.3 血样应在 4 ℃～8 ℃环境下保存，72 h 内进行 CTC 检测。8.2 样本前处理8.2.1 密度梯度离心法8.2.1.1 离心前检查血样，无溶血、凝块即为合格样本。8.2.1.2 将细胞密度梯度分离液置于 37 ℃水浴预热 15 min。水浴锅水位应高于样本液面，确保容器内样本达到目标温度。8.2.1.3 预热后依次加入 15 mL 离心管中。8.2.1.4 手握采血管两端，轻缓 180°翻转采血管 8 次～10 次，充分混匀外周血样本。8.2.1.5 取 1 mL 混匀的血样，按照 1:3 比例加入 3 mL 1×PBS 稀释，用吸管将稀释后的血液缓缓加入密度梯度分离液上层。注：PBS为磷酸缓冲盐溶液（Phosphate Buffered Saline）。8.2.1.6 放置离心机中 400 g～450 g，离心 30 min～40 min。8.2.1.7 离心后分层界面清晰，离心后溶液分为 3 层：上层为血浆层，中层为白膜层，下层为红细胞层。中层为目的细胞收集层，目的细胞层中间有以单个核细胞为主的白膜带，目的细胞截留率＞85％。8.2.1.8 用吸管去除上层血浆后，再将中层目的细胞收集层（2.5 mL～6.5 mL 之间）全部转移至 15 mL离心管中，加入 PBS 定容至 12 mL，盖紧管盖，轻缓 180°翻转离心管数次，放置于离心机中 300 g～350g，离心 5 min～7 min。8.2.1.9 离心后，保留底部约 100 ?g 液体。加入适量 PBS 重悬细胞。8.2.2 红细胞裂解法8.2.2.1 取样：宜在 4 ℃条件下操作，取 1 mL 新鲜抗凝血于离心管中。8.2.2.2 裂解：按照 1:3 比例在离心管中加入 3 mL 1×红细胞裂解液，裂解 5 min。8.2.2.3 离心：在室温下，500 g 离心 5 min，弃红色上清液。8.2.2.4 二次裂解离心：若发现红细胞裂解不完全，可以重复裂解（见 8.2.2.2）和离心（见 8.2.2.3）一次。8.2.2.5 洗涤：加入适量 1×PBS，轻柔混匀重悬沉淀，在室温下，500 g 离心 5 min。8.2.2.6 沉淀：离心后去除上清液，用适量 1×PBS 重悬沉淀细胞。9 样本检测9.1 检测准备9.1.1 CTC 捕获探针活化和分散性评估9.1.1.1 用镊子夹住管壁，离心管倾斜 45°，打开超声清洗仪，左右激烈晃动，保持 1 min 以上。9.1.1.2 取 2 μL 活化后的 CTC 捕获探针均匀铺在载玻片上，肉眼观察无明显沉淀与絮状物。9.1.1.3 必要时于显微镜下观察，要求能均匀分散为细小粒子悬浮于分散介质中而不沉淀、不抱团，CTC 捕获探针活化完成。注1：活化是减少材料团聚，提升材料反应活性，对材料进行化学处理改善材料分散性的处理过程。注2：分散性指材料在水或其他均匀液体介质中，能均匀分散为细小粒子悬浮于分散介质中而不沉淀的性能。注3：分散性评估指用超声清洗仪充分超声分散探针，取少量用粒径分析仪检测探针的粒径分布，其中多分散指数（Polydispersity Index，PDI）≤0.3，说明分散性良好。9.1.2 涂片放置进行离心涂片前按“载玻片+滤纸+涂片漏斗”的顺序依次对齐放置，涂片漏斗孔和滤纸孔对齐；在涂片机上按载玻片正面贴紧滤纸，光滑面朝外的方式夹紧，应无缝隙。9.2 CTC 磁分离捕获9.2.1 无标记捕获探针法9.2.1.1 将洗涤后的细胞沉淀用少量 PBS 重悬在 1.5 mL 离心管中，定容至 1 mL。9.2.1.2 取适量磁性纳米探针加入 1.5 mL 离心管中。9.2.1.3 将加有磁性纳米探针的离心管放置于迷你旋转培养器上，在 4 ℃条件下混匀 6 min～8 min。9.2.1.4 取出离心管后立即置于多功能磁分离器上，在 4 ℃条件下磁吸附 6 min～8 min。注：磁吸附为磁性材料在外加磁场的作用下，从液相中自发地发生材料运动并吸附至磁铁的现象。9.2.1.5 用单道移液器缓慢吸掉上清液，并重新加入适量 PBS，再次颠倒混匀后，立即放入多功能磁分离器，在 4 ℃条件下磁吸附 8 min～10 min。9.2.1.6 用单道移液器缓慢吸掉上清液，取出离心管，加入适量 PBS，将 CTC 捕获探针捕获的细胞轻轻吹打混匀，制备细胞混悬液。9.2.2 多肽纳米探针法9.2.2.1 取混合均匀的抗凝血至离心管中，用 PBS 稀释抗凝血。9.2.2.2 将多肽纳米探针涡旋混匀后，取 10 μL 多肽纳米探针至 2 mL 稀释后的外周血中，混匀后，37 ℃孵育 1 h。9.2.2.3 孵育结束后，将离心管放置在多功能磁分离器上，磁吸附分离 30 min。9.2.2.4 加入 PBS 洗涤，将离心管放置在多功能磁分离器上，缓慢吸掉上清液，重复 2 次～3 次。9.2.2.5 将富集细胞用适量 PBS 重悬混匀为细胞混悬液。注：除磁分离方法，非抗体依赖还有膜过滤法、微流控芯片法等；膜过滤法见附录C，微流控芯片法见附录D。9.3 细胞制片9.3.1 取出干净的载玻片，标记样本信息及检测时间，按“涂片漏斗+滤纸片＋载玻片”的顺序对齐贴合好后放进离心涂片机中。9.3.2 将 0.2 mL～0.5 mL 细胞混悬液加入相应标注的涂片漏斗加样管中，启动离心涂片机，室温下 800 r/min 离心 5 min，离心完成后，轻缓取下载玻片。注1：样本稀释后（即细胞混悬液），轻度浑浊，细胞浓度过高，会造成细胞相互堆叠，影响观察及鉴定；细胞浓度过低，则涂片中细胞稀疏，容易造成假阴性。注2：离心速度过低，细胞结构不清晰，离心速度过高，细胞容易破坏。9.3.3 制片结果为细胞呈单层、分布均匀、细胞形态清晰、结构完整。9.3.4 细胞制片适用无标记捕获探针法、多肽纳米探针法、微流控芯片法，膜滤法无需要采用细胞制片。9.4 CTC 鉴定9.4.1 细胞病理鉴定法（常规染色）细胞病理染色鉴定按以下步骤进行：a) 细胞固定：将制片后得到的细胞片室温晾干，用细胞固定液固定 10 min～15 min；b) 细胞染色：去掉细胞固定液，室温晾干后，依次用细胞质染色液、细胞核染色液进行染色，每种染色液染色 1 min～2 min；c) 封片：细胞染色后，蒸馏水冲洗 2 次～3 次，室温晾干，用封片剂封片；d) 观察：用 10 倍和 40 倍显微镜下观察细胞形态及染色情况，细胞质与细胞核结构清晰后，细胞间没有重叠，非细胞区域没有或仅有微量残留染色液；e) 识别：在 100 倍显微镜下，根据细胞病理学特征识别肿瘤细胞。9.4.2 免疫细胞化学和免疫荧光法9.4.2.1 免疫细胞化学按以下步骤进行：a) 细胞固定：将制片后得到的细胞片室温晾干，细胞固定液固定 10 min～20 min，将细胞片浸入PBS 缓冲液中清洗 3 次，每次 5 min；b) 通透（针对胞内抗原）：用 0.2％ Triton X-100 通透细胞 10 min，用 PBS 缓冲液漂洗 3 次，每次 5 min；c) 封闭：按试剂说明书使用内源性过氧化物酶封闭液封闭，PBS 浸泡 2 次，每次 5 min；非特异性封闭：将反应位置用组化笔画圈，滴加 5％ BSA 封闭液，封闭 30 min；d) 一抗孵育：倒去 BSA 封闭液，将稀释好的一抗（CK、CD45）直接滴加到反应位置，37 ℃湿盒孵育 1 h～2 h，弃去一抗，用 PBS 缓冲液漂洗 3 次，每次 5 min；9.4.3 荧光原位杂交法荧光原位交杂法按以下步骤进行：a) 细胞固定：将制片后得到的细胞片室温晾干，滴加细胞固定液固定，室温晾干；b) 漂洗：将片子置于 2×SSC 缓冲溶液中漂洗 2 次，每次 5 min；注：SSC为柠檬酸钠缓冲液（Saline Sodium Citrate buffer)。c) 消化：滴加适量 0.04％胃蛋白酶溶液，室温消化细胞 10 min～20 min，2×SSC 缓冲液中浸泡洗涤 2 次，每次 5 min；d) 脱水：在 70％、85％和 100％梯度乙醇依次梯度脱水各 5 min，室温晾干；e) 杂交：在暗室，取出探针（见附录 E），室温静置 5 min，用手指轻弹离心管底部，混匀探针后短暂离心，加 10μL 探针溶液至杂交区域，立即盖上盖玻片，探针在盖玻片下均匀展开，用封片胶封片。将玻片置于杂交仪上，45 ℃变性 2 h，或 88 ℃变性 2 min；f) 洗涤：在暗室，用镊子小心撕掉盖玻片周围封片胶，避免粘掉或者移动盖玻片，将片子浸入 2×SSC 中约 0.5 min 后取出，用镊子轻轻将盖玻片揭掉；将玻片置于 2×SSC，室温洗涤 1 min～2 min；取出片子浸入提前 68 ℃预热的杂交后洗涤液（0.4×SSC/0.3％ NP-40）中洗涤 2 min～5 min；取出片子浸入提前预热的去离子水中洗涤 1 min，在暗处自然干燥片子；g) 复染：在暗室晾干片子后，将 10μL 的 DAPI 染色液滴于杂交区域，立即盖上盖玻片放置暗处染色 10 min～20 min。复染步骤中不能立刻进行荧光显微镜观察的玻片应置于-20 ℃条件下保存。9.4.4 逆转录聚合酶链式反应法（RT-PCR）9.4.4.1 RNA 提取按以下步骤进行：a) 细胞匀浆化：取富集的细胞混悬液，400 g 离心 5 min，加入适量 Trizol 反复吹打，溶解细胞；b) 分离 RNA：加入氯仿[氯仿：Trizol（1：5）]，盖好 EP 管上下颠倒剧烈震荡，冰上静置 5 min～10 min，直至上下分层清晰。4 ℃条件下，13 400 g 离心 15 min，样本会分为三层：有机相、中间层和上层无色的水相（RNA 在水相中），收集上清液；c) 沉淀 RNA：上清液中加入等量异丙醇，颠倒 5 次，室温静置 10 min，4 ℃条件下，13 400 g 离心 15 min，离心后在离心管管侧和管底形成胶状沉淀，弃去上清液；d) RNA 洗涤脱盐：加 75％乙醇（用 DEPC 水配制）轻弹底部洗涤沉淀，4 ℃条件下，9 390 g 离心5 min，弃去上清；注：DEPC为焦碳酸二乙酯（Diethyl Pyrocarbonate）。e) RNA 干燥和再溶解：取出滤纸，将 EP 管敞开放在滤纸上，管口向酒精，但不应完全干燥；20 μL～30 μL 的 DEPC 水溶解，取 2 μL 电泳检测完整度（1.5％琼脂糖凝胶电泳，主要观察 28 s、18 s 和 5 s 三条带是否清晰），2μL 用于紫外分光光度计比色，其余冻存于-70 ℃冰箱。9.4.4.2 逆转录反应按以下步骤进行：a) RNA 定量：用紫外分光光度计确定 RNA 浓度并定量；b) 去除 DNA：在无 RNA 酶的 200 μL 干净试管内依次加入 2 μL 细胞总 RNA，2 μL 250 pmoL 随机引物，2μL 2.5 mmol/L 的 dNTP 以及 10μL无 RNA 酶水混匀，瞬时离心后于 70 ℃中 5 min，冰浴中淬冷；c) 逆转录：然后加入 2 μL 10×逆转录缓冲液，1 U/μL 逆转录酶，1 U/μLRNA 酶抑制剂，混匀，瞬时离心后 42 ℃反应 60 min，95 ℃加热 10 min 灭活逆转录酶，-20 ℃保存。9.4.4.3 PCR 扩增应按以下步骤进行：a) PCR 扩增体系（25 μL）：包括 DEPC 水（可用高压双蒸水）17.5 μL，10×Taq buffer 2.5μL，MgCl2 2.0 μL，10 moL/L dNTP Mix 0.5μL ，上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，Tap 酶（5u/μL）0.5 μL，cDNA 模板 1.0 μL；b) PCR 扩增条件：94 ℃预变性 2 min，94 ℃变性 20 s，55 ℃退火 30 s，60 ℃延伸 40 s，45 个循环；c) 循环扩增反应结束后查看扩增曲线及 Ct 值。9.4.4.4 相应的引物扩增相应的基因靶点，逆转录聚合酶链式反应靶点见附录 F。9.4.4.5 常规 PCR 扩增后需采用凝胶电泳、核酸探针杂交等方法分析 PCR 扩增产物。9.4.5 基因测序法9.4.5.1 DNA 提取按以下步骤进行：a) 将 1 mL EDTA 抗凝-20 ℃冻存血液室温解冻后用预冷红细胞裂解液裂解，重复 1 次；b) 沉淀的白细胞团用 STE 缓冲液混匀，加入 SDS 核蛋白酶 K 裂解细胞，消化蛋白；c) 裂解过夜后，加入等体积 Tris 饱和苯酚溶液，转动混匀有机相和水相；d) 离心后用大口吸管转移水相，重复用 Tris 饱和苯酚溶液抽提一次；e) 加等体积氯仿：异戊醇（24:1），离心，小心转移收集水相，重复一次；f) 加入 1/5 体积醋酸钠混匀，再加入 2 倍体积-70 ℃预冷无水乙醇，混匀出现白色絮状，离心收集沉淀；g) 用 2 mL 的 70％乙醇洗涤 2 次，室温挥发干燥，不宜使 DNA 完全干燥；h) 加灭菌的 TE（pH 7.4～8.4）缓冲溶液 2 9.4.5 基因测序法9.4.5.1 DNA 提取按以下步骤进行：a) 将 1 mL EDTA 抗凝-20 ℃冻存血液室温解冻后用预冷红细胞裂解液裂解，重复 1 次；b) 沉淀的白细胞团用 STE 缓冲液混匀，加入 SDS 核蛋白酶 K 裂解细胞，消化蛋白；c) 裂解过夜后，加入等体积 Tris 饱和苯酚溶液，转动混匀有机相和水相；d) 离心后用大口吸管转移水相，重复用 Tris 饱和苯酚溶液抽提一次；e) 加等体积氯仿：异戊醇（24:1），离心，小心转移收集水相，重复一次；f) 加入 1/5 体积醋酸钠混匀，再加入 2 倍体积-70 ℃预冷无水乙醇，混匀出现白色絮状，离心收集沉淀；g) 用 2 mL 的 70％乙醇洗涤 2 次，室温挥发干燥，不宜使 DNA 完全干燥；h) 加灭菌的 TE（pH 7.4～8.4）缓冲溶液 2 9.4.5 基因测序法9.4.5.1 DNA 提取按以下步骤进行：a) 将 1 mL EDTA 抗凝-20 ℃冻存血液室温解冻后用预冷红细胞裂解液裂解，重复 1 次；b) 沉淀的白细胞团用 STE 缓冲液混匀，加入 SDS 核蛋白酶 K 裂解细胞，消化蛋白；c) 裂解过夜后，加入等体积 Tris 饱和苯酚溶液，转动混匀有机相和水相；d) 离心后用大口吸管转移水相，重复用 Tris 饱和苯酚溶液抽提一次；e) 加等体积氯仿：异戊醇（24:1），离心，小心转移收集水相，重复一次；f) 加入 1/5 体积醋酸钠混匀，再加入 2 倍体积-70 ℃预冷无水乙醇，混匀出现白色絮状，离心收集沉淀；g) 用 2 mL 的 70％乙醇洗涤 2 次，室温挥发干燥，不宜使 DNA 完全干燥；h) 加灭菌的 TE（pH 7.4～8.4）缓冲溶液 2μL～50 μL溶解 DNA，-20 ℃保存。9.4.5.2 PCR 扩增：同 9.4.4.3。9.4.5.3 测序：按测序仪说明书操作进行对 PCR 纯化产物进行测序，分析测序结果，宜根据不同癌种的选择测序方式，测序类别见附录 G。～50 μL 溶解 DNA，-20 ℃保存。9.4.5.2 PCR 扩增：同 9.4.4.3。9.4.5.3 测序：按测序仪说明书操作进行对 PCR 纯化产物进行测序，分析测序结果，宜根据不同癌种的选择测序方式，测序类别见附录 G。10 测定结果有效性判定细胞病理鉴定法10.1.1 病理学中不同类型的肿瘤细胞主要有以下六项形态特征：——细胞长直径＞15 ?m；——细胞核质比＞0.8；——细胞质内常见空泡或脂肪粒；——细胞核深染且染色不均，核仁明显；——核形态不一，可为巨核、双核或多核；——细胞表面褶皱或边界清楚。10.1.2 若测定结果明确不是外周血中的正常白细胞，且满足上述 3 项或 3 项以上特征则判定测定结果有效；否则，测定结果判定为无效。10.2 免疫细胞化学和免疫荧光法10.2.1 测定结果有效性如下：——阳性对照：阳性对照可作为正确样本准备和适当染色技术的指示。每次染色应与同一测试条件下的阳性对照片进行比较。阳性对照仅用于监控步骤的正确执行和试剂的测试，并不用于帮助叙述样本的明确诊断，若阳性结果不能显示适当的阳性染色，则该批次实验测试样本的结果认为是无效的；——阴性对照：每次染色应与同一测试条件下的空白对照试剂进行对比。空白试剂代替抗体对玻片进行染色用来判断非特异性着色，并对抗原部位特异性染色提供更好的解释，空白对照试剂的孵育时间应与抗体一致；——肿瘤细胞和正常细胞应同时具备细胞核染色。阳性标记免疫特征，可分为弱阳性（+）、中等阳性（++）、强阳性（+++）三级，免疫酶标记表现为淡黄色细颗粒、棕黄色颗粒和褐黄色粗颗粒，后者耀眼易见。免疫荧光法则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光。10.3 荧光原位杂交法10.3.1 测定结果有效性如下：——阳性对照：细胞染色体任意两个以上位点（含两个）出现异常或一个位点有两种以上（含两个）异常（基因删除/扩增、基因融合或基因重排）；——阴性对照：细胞染色体无异常信号。10.3.2 染色体异常且细胞核染色阳性的细胞为肿瘤细胞，染色体异常有基因删除/扩增、基因融合或基因重排，判定方法如下：——基因扩增：单色探针通常计数每个肿瘤细胞信号的绝对量，而双色探针则计算每个肿瘤细胞靶基因位点信号与参考染色体信号的比值；——染色体易位：可发生在染色体内或染色体间。少数情况下，易位也可出现其中一个分离探针信号的丢失；注1：发生在染色体内，以分离探针信号之间达到1倍～2倍信号直径的间距判定易位。注2：发生在染色体间，应有清楚的独立信号。——基因缺失：在应用单色探针（即没有参考染色体探针）时，需要增加计数细胞的数量，避免由于玻片导致的信号缺失而判读为阳性结果；双色探针以上的多色探针对其中的每种信号可以有不同的阈值要求。10.4 逆转录聚合酶链式反应法（RT-PCR）10.4.1 测定结果有效性如下：——阳性对照：有典型 S 型扩增曲线（确定扩增体系有效）；——阴性对照：为直线或轻微斜线，无指数增长期（排除扩增体系出现污染）；——PCR 熔解曲线是单峰曲线；——扩增曲线指数扩增区域，复孔之间 CT 值标准偏差应＜0.2；——阈值设置合理（设置在指数增长区）；——扩增效率在 90％～110％之间，标准曲线 R＞0.99、R2＞0.98；标准方差应＜0.2。阳性处理结果 Ct 约为 15～30；阴性对照结果 Ct＞35。10.4.2 结果判定：——阴性：F≤A；——阳性：F＞A。F=2-?Ct，?Ct=（Ct 检测组基因 1-Ct 检测组基因 2）-（Ct 对照组基因 1-Ct 对照组基因 2），其中基因1 为 EpCAM、CK19 等待检基因，基因 2 为?-Actin，GAPDH 等内参基因，Ct 是检测样本的阈值；——A 为特定基因（如 EpCAM、CK19 等）的相对基因量在阴性样本与阳性样本之间的临界值。10.5 基因测序法10.5.1 测定结果有效性如下：——测序结果为单个峰且与其他峰的交错较少，表明测序结果有效；——若单个峰的一个位点出现多个峰，表明测序结果无效。10.5.2 结果判定：——阳性：检测到特定基因突变；阳性判断值为突变比例不低于 0.4％，测序有效深度不低于 500×，突变绝对拷贝数不低于 2，链平衡性介于 0.1～0.9 之间（融合不适用）；——阴性：未检测到特定基因突变。示例：特定基因突变，如：EGFR 基因/20 号外显子 p.T790 错义突变/c.2369C>T/P.Thr790Met，突变丰度为 1.22％。11 测定结果11.1 测定结果表述11.1.1 细胞病理鉴定法11.1.1.1 在 2 mL 血样中检出单个 CTC、白细胞群围绕的 CTC 或 CTC 团簇即为阳性，在恶性实体肿瘤中CTC 不少于 5 个时，提示临床预后差。11.1.1.2 在 2 mL 血样中进行检测，未检测到单个 CTC、白细胞群围绕的 CTC 或 CTC 团簇即为阴性，提示检测样本无 CTC。11.1.1.3 结果应按照合适的病人管理程序与来自诊断测试（即影像学、实验室检查）、体检和完整病史等信息结合使用。11.1.2 免疫细胞化学和免疫荧光法11.1.2.1 在 2 mL 血样中检出有棕黄色着色或表现绿色荧光的抗原阳性（如 EpCAM、CK19 等）的单个CTC、白细胞群围绕的 CTC 或 CTC 团簇。11.1.2.2 在 2 mL 血样中未检测出有棕黄色着色或表现绿色荧光的抗原阳性（如 EpCAM、CK19 等）的单个 CTC、白细胞群围绕的 CTC 或 CTC 团簇。11.1.3 荧光原位杂交法11.1.3.1 在 2 mL 血样中检出染色体异常（基因删除/扩增、基因融合或基因重排）的单个 CTC、白细胞群围绕的 CTC 或 CTC 团簇。11.1.3.2 在 2 mL 血样中未检测出染色体异常（基因删除/扩增、基因融合或基因重排）的单个 CTC、白细胞群围绕的 CTC 或 CTC 团簇。11.1.4 逆转录聚合酶链式反应法（RT-PCR）11.1.4.1 在 2 mL 血样中检出特定生物标志物（如 EpCAM、CK19 等）扩增异常/表达异常的 CTC。11.1.4.2 在 2 mL 血样中未检出特定生物标志物（如 EpCAM、CK19 等）扩增异常/表达异常的 CTC。11.1.5 基因测序法11.1.5.1 在 2 mL 血样中检出具有特定基因突变（如 EGFR、Her2 等）的 CTC。11.1.5.2 在 2 mL 血样中未检出具有特定基因突变（如 EGFR、Her2 等）的 CTC。11.2 测定结果使用11.2.1 荧光原位杂交法、逆转录聚合酶链式反应法（RT-PCR）均要求应在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，应重新实验。11.2.2 11.1 方法获得的最终结果应按照合适的采样者管理程序与来自诊断测试（即影像学、实验室检查）、体检和完整病史等所有的临床信息结合使用。12 注意事项12.1 安全管理实验室安全管理及工作人员行为符合GB 19489的规定。工作人员处理血液的全部操作应戴乳胶一次性手套、口罩和实验帽。12.2 试剂材料防污染应对实验室进行功能分区，各区的工作服实验用具和实验记录本应区分标记，不应混用。注意因交谈或其他活动造成的飞沫、落尘带入的污染，必要的情况下在超净工作台中进行操作。12.3 废弃物处理操作区应有专门的固体和液体废弃物收集容器，废弃物应进行无害化处理