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兽用中药材 茯苓
发布日期: 2024-08-19
实施日期: 2024-09-18
主要技术内容:1 性状根据《中华人民共和国兽药典》二部茯苓的质量标准,以及7批来源于湖北、湖南、河南、安徽、贵州、云南、广西、浙江等不同产地的茯苓药材实际性状,确定性状为:茯苓个:呈类球形、椭圆形、扁圆形或不规则团块,大小不一。外皮厚而粗糙,棕褐色至黑褐色,有明显的皱缩纹理。体重,质坚实,断面颗粒性,有的具裂隙,外层淡棕色,内部白色,少数淡红色,有的中间抱有松根。气微,味淡,嚼之粘牙。茯苓块:为去皮后切制的茯苓,呈立方块状或方块状厚片,大小不一。白色、淡红色或淡棕色。茯苓片:为去皮后切制的茯苓,呈不规则厚片,厚薄不一.白色、淡红色或淡棕色。2  菌丝显微鉴别按照《中华人民共和国兽药典》 二部  茯苓【鉴别】项(1)测定。三批不同产地的茯苓均能检出无色不规则颗粒状团块和分枝状团块,遇水合氯醛液渐溶化。菌丝无色或淡棕色,细长,稍弯曲,有分枝,直径3μm~8μm,少数至16μm,显微特征见图1。图1 不规则颗粒状团块和分枝状团块 (400×)3  多糖鉴别按照《中华人民共和国兽药典》二部 茯苓【鉴别】项(2)测定。分别取三批不同产地的茯苓粉末少量,加碘化钾碘试液1滴,均显深红色。4  茯苓鉴别按照《中华人民共和国兽药典》二部板茯苓【鉴别】项(3)测定。对三批不同产地的茯苓试验结果表明,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的主斑点。结果见图2。图2  1.茯苓对照药材 2-4 依次批号20231001、20231002、20231003样品三批不同产地的茯苓均符合规定。5  水分按照《中华人民共和国兽药典》 二部 附录0832 干燥失重测定法 测定。结果见表1。表 1  三批样品水分测定结果批号 水分(%) 平均值(%) RSD%(n=6)20231001 9.28 9.24 9.31 9.2 0.318.94 9.07 9.1720231002 8.87 8.79 8.99 9.0 0.919.31 8.91 9.0420231003 9.10 9.15 8.84 9.1 1.59.20 9.17 9.04批间均一性 9.1 RSD=1.8%(n=18)三批样品中的水分平均值为9.1%,符合兽药典不能超过18.0%的规定。试验结果表明,批内均一性、批间均一性均符合要求,证明本品工艺稳定。结合兽药典的规定、实测值并考虑实验室间的误差,水分标准在平均值的基础上上调至130%左右,确定水分 ≤12.0 %。6  总灰分按照《中华人民共和国兽药典》二部  附录2302测定。结果见表2。表2 三批样品总灰分测定结果批号 总灰分(%) 平均值(%) RSD(%)20231001 0.898 0.917 0.925 0.91 1.60.921 0.932 0.89220231002 0.969 0.945 0.927 0.95 2.40.953 0.931 0.99220231003 0.943 0.962 0.986 0.96 3.00.922 0.952 1.01批间均一性 0.94 RSD=3.3%(n=18)三批样品中的灰分平均值为0.94%,符合兽药典不能超过2.0%的规定。试验结果表明,批内均一性、批间均一性均符合要求,证明本品工艺稳定。考虑实验室间检测误差等因素,灰分标准在平均值的基础上上调至150 %左右,定为灰分≤1.5 %。7  浸出物按照《中华人民共和国兽药典》二部  附录2201测定。结果见表3。表3 三批样品浸出物测定结果批号 浸出物含量(%) 平均值(%) RSD(%)20231001 4.01 4.06 4.03 4.1 1.14.14 4.10 4.0520231002 4.11 4.15 4.09 4.1 0.574.15 4.10 4.1320231003 4.08 4.16 4.10 4.1 0.734.12 4.09 4.07批间均一性 4.1 RSD=0.10%(n=18)三批样品中的浸出物平均值为4.1 %,符合兽药典不能少于2.5 %的规定。试验结果表明,批内均一性、批间均一性均符合要求,证明本品工艺稳定。虑实验室间检测误差等因素,浸出物标准在平均值的基础上下调至80 %左右,定为浸出物不得少于3.0 %。8  含量测定参考文献方法,茯苓多糖在硫酸作用下脱水生成糠醛衍生物,与苯酚生成橙红色物质,在490nm有最大吸收,用紫外-可见分光光度法测定,对照品比较法定量。8.1 仪器设备紫外-可见分光光度计;分析天平:感量0.1mg,0.01mg。8.2 试剂或材料除非另有规定,仅使用分析纯试剂。水:符合GB/T 6682,一级水。50%硫酸:取硫酸50mL,用水稀释至100mL。5%苯酚:取苯酚5mL,用水稀释至100mL。对照品溶液的制备:取经105℃干燥至恒重的D-无水葡萄糖对照品10mg,精密称定,置100mL量瓶中,加50%硫酸使溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。8.3 分析步骤8.3.1 供试品溶液制备取本品约10mg,精密称定,置100mL量瓶中,加50%硫酸溶液适量,密塞,用力振摇,超声处理10分钟使溶解,加50%硫酸溶液稀释至刻度,摇匀。再精密量取2mL于10mL量瓶中,用50%硫酸溶液稀释至刻度,摇匀作为供试品溶液。8.3.2 测定分别精密量取供试品溶液及对照品溶液各2mL置20mL具塞试管中,分别加入5%苯酚1.8mL,充分混合后,再分别缓慢加入6mL硫酸,立即混匀,25℃水浴40min,取出,以相应试剂作空白参比,在490nm波长处测定吸光度,即得。8.4 测定方法优化⑴ 测定波长的选择取D-葡萄糖对照品和茯苓样品粉末适量,精密称定,照4.2.6.2对照品溶液制备方法和4.2.6.3.1供试溶液制备方法制备,分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液、纯化水各2mL,于20mL具塞试管中,分别加入5%苯酚溶液1.8mL,充分混合后,再分别缓慢加入6mL浓硫酸,立即混匀,水浴锅内25℃放置40分钟,以纯化水反应的溶液做空白,在紫外-可见分光光度计上于400-600nm波长范围内进行扫描。结果表明,供试品溶液和对照品溶液在490nm处均有最大吸收,故选择测定波长为490nm,见图3、4。图3  供试品溶液UV图谱图4  D-无水葡萄糖对照品溶液UV图谱⑵ 反应温度选择取茯苓粉末样品,照4.2.6.3.1项下供试溶液制备方法制备20mL,精密量取10mL至50mL量瓶中,用50%硫酸溶液稀释至刻度,摇匀,取20mL具塞试管5支,分别精密量取2mL样品于20mL具塞试管中,加入5%苯酚溶液1.8mL,充分混合后,再分别缓慢加入6mL浓硫酸,立即混匀,5支试管中的样品分别在20℃、25℃、40℃、60℃、80℃水浴,水浴时间40分钟,于490nm波长测定样品吸光度值。结果显示,在25℃水浴条件下反应的溶液吸光度最强,故选择25℃为水浴温度。测定结果见表4。表4 反应温度考察结果水浴温度 20℃ 25℃ 40℃ 60℃ 80℃1 0.2505 0.2627 0.2332 0.2227 0.22982 0.2503 0.2624 0.2329 0.2218 0.22843 0.2507 0.2626 0.2325 0.2232 0.22404 0.2501 0.2617 0.2340 0.2241 0.22665 0.2510 0.2630 0.2347 0.2246 0.2259均值 0.251 0.262 0.233 0.223 0.227⑶ 反应时间选择取茯苓样品粉末,照4.2.6.3.1项下的方法配制成供试品溶液,精密量取2mL至10mL量瓶中,用50%硫酸溶液稀释至刻度,摇匀,精密量取2mL于20mL具塞试管中,分别加入5%苯酚溶液1.8mL,充分混合后,再分别缓慢加入6mL浓硫酸,立即混匀,25℃下水浴10分钟、20分钟、40分钟、60分钟、80分钟,于490nm波长处测定样品吸光度值,结果见表5。表5 反应时间考察结果水浴时间(min) 10 20 30 40 60 801 0.2643 0.2626 0.2620 0.2711 0.2596 0.25742 0.2644 0.2630 0.2634 0.2703 0.2604 0.25783 0.2641 0.2637 0.2635 0.2698 0.2600 0.25774 0.2645 0.2635 0.2631 0.2713 0.2597 0.25705 0.2646 0.2641 0.2634 0.2704 0.2601 0.2579均值 0.264 0.263 0.263 0.271 0.260 0.258结果表明,茯苓多糖在水浴40分钟时,吸光度值最大,因此选择水浴时间为40分钟。苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖,并迅速脱水生成糖醛衍生物,然后与苯酚生成橙黄色化合物,再以比色法测定。结合反应时间及反应温度因素试验结果,水浴时间过长、温度过高,可能会造成糖醛衍生物与苯酚生成的中间产物不稳定。因此,本方法选用25℃下水浴40分钟的条件。⑷ 5%苯酚溶液加入量选择取D-葡萄糖对照品适量,照4.2.6.2项下的方法配制成对照品溶液,精密量取2mL至10mL量瓶中,用50%硫酸溶液稀释至刻度,摇匀,精密量取2mL于20mL具塞试管中,分别加入5%苯酚溶液0.2mL、0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、1.8mL、2.0mL,再分别加入水1.8mL、1.6mL、1.2mL、0.8mL、0.4mL、0.2mL、0mL,充分混合后,再分别缓慢加入6mL硫酸,立即混匀,25℃水浴40分钟,于490nm波长测定样品吸光度值,从图表可见,5%苯酚加入量为1.8mL时,吸光度有最大值,因此5%苯酚加入量定为1.8mL。结果见表6。表6  5%苯酚加入量考察加入量(mL) 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 1.8 2.01 0.0693 0.1326 0.2125 0.2468 0.2622 0.2681 0.22032 0.0690 0.1326 0.2127 0.2470 0.2628 0.2684 0.22183 0.0692 0.1325 0.2124 0.2463 0.2624 0.2687 0.22104 0.0694 0.1328 0.2126 0.2461 0.2619 0.2682 0.22075 0.0692 0.1324 0.2123 0.2464 0.2623 0.2684 0.2215均值 0.069  0.133  0.213  0.247  0.262  0.268  0.221⑸硫酸加入量选择取D-葡萄糖对照品,照4.2.6.2项下的方法的方法配制成对照品溶液,精密量取2mL至10mL量瓶中,用50%硫酸溶液稀释至刻度,摇匀,精密量取2mL于20mL具塞试管中,分别加入5%苯酚溶液1.8mL,立即混匀,分别精密加入硫酸4.0mL、5.0mL、5.5mL、6.0mL、6.5mL、7.0mL、8.0mL。于490nm波长测定样品吸光度值,从图表可见,在结果表明,硫酸加入量为6.0mL时,测定结果值最大,因此硫酸加入量定为6.0mL。加入硫酸的量偏小,导致水解反应不完全,而加入硫酸过多,可能会造成糖醛衍生物与苯酚生成的中间产物不稳定。测定结果见表7。表7  硫酸加入量考察加入量(mL) 4.0 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 8.0吸光度(A) 0.1184 0.2622 0.2552 0.2610 0.2430 0.2186 0.2030总体积 7.8 8.8 9.3 9.8 10.3 10.8 11.8吸光度与体积乘积 0.9235 2.3074 2.3734 2.5580 2.5029 2.4702 2.49698.5 方法学验证⑴ 线性关系考察取D-葡萄糖对照品,照4.2.6.2配制成对照品溶液,精密吸取对照品溶液各1mL、2mL、3mL、4mL、5mL,分别置于5个10mL量瓶中,加50%硫酸溶液稀释至刻度,得浓度分别为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的溶液。精密量取2mL,置20mL具塞试管中,分别加入5%苯酚溶液1.8mL,充分混合后,再分别缓慢加入6mL硫酸,立即混匀,25℃水浴40分钟,在490nm波长处测定吸光度,以吸光度为纵坐标(Y),浓度为横坐标(X),绘制标准曲线。得回归方程为Y=0.0125X-0.0678 r=0.9994,n=6),结果见表10,D-无水葡萄糖在10.19μg/mL~61.14μg/mL范围内线性关系良好,结果见表8,回归曲线图见图5。表8 D-无水葡萄糖线性关系考察结果葡萄糖对照品浓度(μg/mL) 吸光度(A)10.19 0.060020.38 0.185230.54 0.308440.76 0.448550.85 0.574461.14 0.6891图5  D-无水葡萄糖线性回归方程图⑵ 精密度试验取D-葡萄糖对照品6份,照4.2.6.2的方法配制照品溶液,分别精密量取2mL于6支20mL具塞试管中,分别加入5%苯酚溶液1.8mL,混匀,分别加入硫酸6.0mL,立即混匀,25℃水浴40分钟,于490nm波长测定样品吸光度值。结果见表9。计算其吸光度与重量的比值,RSD值为0.16%,表明该方法精密度良好。表9 精密度试验结果试验号 1 2 3 4 5 6对照品重量 10.19 10.21 10.24 10.20 10.21 10.22吸光度(A) 0.3064 0.3074 0.3085 0.3081 0.3081 0.3082吸光度/重量 0.03007 0.03011 0.03013 0.03021 0.03018 0.03016RSD(%) 0.16⑶稳定性试验取茯苓供试品粉末适量,照4.2.6.2的方法配制成供试品溶液,取20mL具塞试管6支,分别精密量取供试品溶液2 mL,分别加入5%苯酚溶液1.8mL,混匀,分别加入硫酸6.0mL,立即混匀,25℃水浴40分钟,取出,暗处放置0、10、20、40、80、120分钟,于490nm波长处测定样品吸光度值,结果见表23。计算吸光度的RSD值为1.66%,表明供试品溶液在制备120分钟内稳定性良好。表10  稳定性试验结果放置时间(min) 0 10 20 40 80 120吸光度(A) 0.333 0.339 0.345 0.344 0.348 0.347RSD(%) 1.66⑷重复性试验取茯苓供试品粉末适量,精密称取6份,每份约10mg,照4.2.6.3.1的方法配制供试品溶液,分别精密量取各供试品溶液2 mL,分别加入5%苯酚溶液1.8mL,混匀,分别加入硫酸6.0mL,立即混匀,25℃水浴40分钟,于490nm波长测定样品吸光度值,计算含量。结果见表11,样品中总多糖的平均含量为74.09%,RSD为0.92%,表明本方法重现性好。表11 重复性试验结果试验次数 总多糖含量(%) ±SD (%) RSD(%)1 73.85 74.09±0.77 0.922 74.773 74.844 74.575 73.606 72.90⑸ 加样回收率试验取批号为20231001的样品,称取9份,每份约5mg,精密称定。分别加入D-无水葡萄糖对照品约5mg,照4.2.6.2的方法制成供试品溶液。再精密量取各供试品溶液2 mL,分别加入5%苯酚溶液1.8mL,混匀,分别加入硫酸6.0mL,立即混匀,25℃水浴40分钟,于490nm波长测定样品吸光度值,计算回收率。结果见表12,平均回收率为99.31%,RSD为1.12%,表明方法回收率良好。表12 加样回收率试验结果供试品号 称样量(mg) 含多糖量(mg) 加入量(mg) 实测量(mg) 回收率(%) (%) RSD(%)1 5.12 3.3054 4.12 7.3000 98.51 99.31 1.122 5.21 3.3811 4.02 7.3566 99.473 4.97 3.1793 4.05 7.0104 97.344 5.21 3.3811 4.98 8.4481 100.935 5.20 3.3727 4.94 8.1851 98.636 5.28 3.4400 5.09 8.5576 100.297 5.09 3.2802 6.04 9.2159 98.998 5.12 3.3054 5.99 9.3438 100.479 5.13 3.3138 6.01 9.2454 99.24⑹样品的测定取茯苓三批(批号20231001、20231002、20231003),每批样品30g,研细,取6份,每份约10mg,精密称定,照4.2.6.2的方法制成供试品溶液,分别精密量取各供试品溶液2 mL,分别加入5%苯酚溶液1.8mL,混匀,分别加入硫酸6.0mL,立即混匀,25℃水浴40分钟,于490nm波长测定样品吸光度值,计算含量。结果见表13。表13  三批样品总多糖含量测定结果批号 总多糖含量(%) 平均值(%) RSD(%)20231001 73.85 74.77 74.84 74.09 0.9274.57 73.60 72.9020231002 72.96 73.70 72.25 72.84 0.9171.71 72.90 73.5220231003 74.78 72.30 74.42 73.85 1.0974.09 73.25 74.25批间均一性 =73.59%  RSD%=1.10(n=18)根据上述含量测定结果,考虑到药材的来源及质量差异,以及药材生产储藏等因素的影响,在平均值的基础上下调至80%左右,故暂定本品按干燥品计算,含总多糖以D-无水葡萄糖(C6H12O6)计,不得少于60.0%。9  贮存和有效期9.1 贮存取茯苓块(批号:23040801),按照《中华人民共和国兽药典》一部  附录9001 【原料药物与制剂稳定性试验指导原则】执行,进行稳定性研究影响因素试验,包括高温、高湿及强光照射试验。结果见表14。表14  样品稳定性试验影响因素试验结果表影响因素 时间(天) 性状 吸湿性(%) 总多糖(%)// 0 白色 0 74.12高温 5 白色 减重4.43 74.7910 白色 减重6.28 75.06高湿(75%) 5 白色 增重13.57 74.4610 白色 增重20.85 74.19强光 5 白色 减重2.43 75.0310 白色 减重3.57 74.89结果表明:本品易吸潮,同时在高温及强光照射下,性状、含量稳定。因此本品贮存条件应置干燥处、防潮。9.2 有效期规定在符合规定的贮存和运输条件下,贮存期与标签标识一致,即各生产企业自行规定有效期
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