范围:本文件规定了咖啡生豆中氨基酸总量测定的术语和定义，原理、仪器和器皿，试剂和溶液、分析步骤，结果计算和检测报告的方法。 本文件适用于咖啡生豆中氨基酸总量的测定; 主要技术内容:1　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。1.1  咖啡生豆咖啡生豆即未烘焙过的咖啡豆，按GB/T 18007 的5.6规定执行1.2  茚三酮比色法按GB 5009.124规定执行2　原理氨基酸在pH8.0的条件下与茚三酮反应，形成紫色络合物，用分光光度法在570 nm的波长下测定其含量。3　仪器和器皿3.1  分析天平：感量0.0001 g。3.2  可见光分光光度仪。3.3  安瓿瓶。3.4  陶瓷蒸发皿。3.5  比色管：磨口，50 mL。3.6  比色杯：1 cm。3.7  容量瓶：25 mL、50 mL、100 mL、1000 mL。3.8  酒精喷灯。3.9  研磨机或组织粉碎机。4　试剂和溶液除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯（AR），水为蒸馏水。4.1  试剂4.1.1  亮氨酸：纯度≥98%。4.1.2  浓盐酸（HCl）：质量分数≥36%。4.1.3  磷酸氢二钠（Na2HPO4?12H2O）。4.1.4  磷酸二氢钾（KH2PO4）。4.1.5  茚三酮：纯度≥95%。4.1.6  氯化亚锡（SnCl2?2H2O）。4.2  溶液配制4.2.1  6 mol/L盐酸溶液：取500 mL浓盐酸（6.1.2）加水稀释至1000 mL，混匀。4.2.2  pH8.0磷酸盐缓冲液配制4.2.2.1  1/15 mol/L磷酸氢二钠：称取11.9 g十二水磷酸氢二钠（Na2HPO4?12H2O），加水溶解后定容至1000 mL。4.2.2.2  1/15 mol/L磷酸二氢钾：称取经110 ℃烘干2小时的磷酸二氢钾（KH2PO4）0.908 g，加水溶解后定容至100 mL，摇匀备用。4.2.2.3  取1/15 mol/L磷酸氢二钠溶液（6.2.2.1）950 mL和1/15 mol/L磷酸二氢钾溶液（6.2.2.2）50 mL，混匀，该混合溶液pH为8.0。4.2.3  2%茚三酮溶液配制称取茚三酮（纯度≥95%）2 g，加50 mL水和80 mg氯化亚锡（SnCl2?2H2O）搅拌均匀。分次加少量水溶解，放在暗处，静置一昼夜，过滤后加水定容至100 mL容量瓶中，摇匀备用。4.2.4  标准溶液配制4.2.4.1 亮氨酸10 mg/mL标准储备液：精确称量亮氨酸（纯度≥98%）0.25 g，用蒸馏水溶解后，定量转入25 mL容量瓶中，加水至标线，摇匀，此时标准储备液1 mL含有10 mg的亮氨酸。4.2.4.2 亮氨酸标准系列工作溶液：精确移取0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL、3.00 mL标准储备液（6.2.4.1），分别加水定容至50 mL容量瓶中，摇匀。该系列标准工作液1 mL分别含有0.10 mg、0.20 mg、0.30 mg、0.40 mg、0.50 mg、0.60 mg亮氨酸。5　分析步骤5.1  样品制备取样按照NY/T1518的规定执行，样品制备按照GB5009.124-2016中5.1的规定。5.2  样品试液制备称取试样100 mg～200 mg（0.1 mg），于10 mL安瓿瓶中，准确加入10 mL 6 mol/L盐酸溶液，用酒精喷灯封口，封口后的安瓿瓶放入110℃±1恒温箱内水解24 h后，取出冷却至室温。打开安瓿瓶将水解液全部转移至陶瓷蒸发皿中，70℃水浴蒸干，加水溶解后过滤至容量瓶中用水定容至100 mL，制成待测液，备用。5.3  测定准确吸取待测液（7.2）1 mL，注入50 mL比色管中，加0.5 mL pH8.0磷酸缓冲液（6.2.2）和0.5 mL 2%茚三酮溶液（6.2.3），混合均匀，在沸水浴中加热15 min，立即冷却后加水定容至50 mL。放置10 min后，1 cm比色杯，在570 nm处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度(A)。5.4  亮氨酸标准曲线的制作分别准确吸取1 mL亮氨酸系列标准工作液（6.2.4.2）于一组50 mL比色管中，按7.3的操作测定吸光度(A)。将测得的吸光度作为y坐标，对应的亮氨酸含量作为x坐标，绘制标准曲线。5.5  空白试验除不加试样外，均按上述测定步骤进行。6　结果计算6.1  计算方法咖啡生豆中氨基酸总量以干基质量分数（%）表示，按式（1）计算：式中：C —根据7.4测定的吸光度从标准曲线上查得的亮氨酸的毫克数，单位为毫克（mg）；V1 —试液总量，单位为毫升（mL）；V2 —测试用试液量，单位为毫升(mL)；m —试样重量，单位为克（g）；ω —试样干物质含量（质量分数）（%）。取两次测定的算数平均值作为结果，保留小数点后2位。6.2  重复性在重复条件下同一样品获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。7　检测报告检测报告应包括下列内容：——使用的方法；——测定的结果（取小数点后两位）；——试样的规格、名称、产地、品种；试验日期、操作人员