主要技术内容:1  范围本标准要求用于新疆地区葡萄干。本标准规定了葡萄干中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、赭曲霉毒素A、T-2毒素、伏马毒素B2、展青霉素的检验方法。本文件适用于本地区葡萄干中8种真菌毒素残留量的检测。2  规范性引用文件本文件中引用的文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682  分析实验室用水规格和试验方法3  术语和定义本文无术语和定义。4  原理试样经粉碎，用1%甲酸-乙腈溶液提取，提取液经分散固相萃取净化，液相色谱-三重四级杆质谱仪测定，外标法定量。5  试剂与材料除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T 6682中规定的一级水。5.1  试剂5.1.1 乙腈（色谱纯）；5.1.2 氯化钠（分析纯）；5.1.3 无水硫酸镁（分析纯）；5.1.4 甲酸（色谱纯）；5.1.5 柠檬酸钠二水合物（分析纯）；5.1.6 柠檬酸二钠盐倍半水合物（分析纯）；5.1.7 1%甲酸-乙腈溶液：量取10mL甲酸用乙腈定容至1000mL容量瓶中，混匀；5.1.8 0.1%甲酸-水溶液：量取1mL甲酸用纯水定容至1000mL容量瓶中，混匀；5.2  标准品黄曲霉毒素B1（CAS号：1162-65-8），纯度大于98 %、黄曲霉毒素B2（CAS号：7220-81-7），纯度大于98 %、黄曲霉毒素G1（CAS号：1165-39-5），纯度大于98 %、黄曲霉毒素G2（CAS号：7241-98-7），纯度大于98 %、赭曲霉毒素A（CAS号：303-47-9），纯度大于98 % 、T-2毒素（CAS号：21259-20-1），纯度大于98 %、伏马毒素B2（CAS号：116355-84-1），纯度大于95 %、展青霉素（CAS号：149-29-1），纯度大于98 %。5.3  标准溶液配制5.3.1 展青霉素标准储备液的配制（1 mg/mL）：准确称取展青霉素标准品10 mg用乙腈定容至10 mL，-18 ℃冷冻避光保存，有效期12个月。5.3.2 展青霉素标准中间液的配制（10 μg/mL）：准确吸取展青霉素标准储备液1.0 mL用乙腈定容至100 mL，-18 ℃冷冻避光保存，有效期6个月。5.3.3 其他7种真菌毒素混合标准储备液的配制（1 mg/mL）：分别准确称取7种毒素标准品各10 mg用甲醇定容至10 mL，-18 ℃冷冻避光保存，有效期12个月。5.3.4 其他7种真菌毒素混合标准中间液的配制（10 μg/mL）：准确吸取混合标准储备液1.0 mL用甲醇定容至100 mL，-18 ℃冷冻避光保存，有效期6个月。5.4  材料5.4.1 乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶（PSA）：粒径：40~60 μm；5.4.2 十八烷基硅烷键合硅胶（C18）：粒径：50 μm；5.4.3 石墨化炭黑（GCB）：粒径40~120 μm；5.4.4 陶瓷均质子：2 cm（长）×1 cm（外径），或相当者；5.4.5 微孔滤膜：13 mm×0.22 μm，或相当者。6  仪器和设备6.1 液相色谱-三重四级杆质谱联用仪：配有电喷雾电离源（Electrospray ionization, ESI）；6.2 电子天平：感量0.01g和0.01 mg；6.3 离心机：转速不低于5000 rpm；6.4 超声清洗仪；6.5 组织捣碎机。6.6 涡旋混合器。7  分析步骤7.1  试样制备随机取干制葡萄样品500 g，粉碎机粉碎后备用。7.2  试样提取准确称取2 g粉碎样品（精确至0.01g）于50 mL离心管中，加入10 mL水，静置30 min，加入10 mL1 %甲酸-乙腈提取液、1粒陶瓷均质子，涡旋混匀30 s，加入5g~7g氯化钠、1g柠檬酸钠二水合物、0.5g柠檬酸二钠盐倍半水合物，涡旋混匀30 s，超声提取20 min，5000 rpm下离心5 min，吸取2 mL上清液至含有150 mg无水硫酸镁、50 mg PSA、50 mg C18的塑料离心管内，对于颜色较深的样品，离心管内另加入25 mg GCB，涡旋混匀30 s，静置沉降1 min，取上清液过滤膜（5.4.5），待测定。7.3  测定7.3.1  液相色谱参考条件色谱柱：当测定展青霉素时，采用T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，粒度1.8 μm)，或同等性能的色谱柱；当测定其他7种真菌毒素时，采用C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，粒度1.9 μm)，或同等性能的色谱柱。流动相：当测定展青霉素时，A：水，B：乙腈；当测定其他7种真菌毒素时，A：0.1 %甲酸-水，B：甲醇。梯度洗脱程序见表1。流速：0.2 mL/min；柱温40 ℃；进样量：2 μL。表1  梯度洗脱程序时间/min　VA　VB0.0　90　102.0　90　105.0　10　907.0　10　907.5　90　1010.0　90　107.3.2  质谱参考条件离子源类型：电喷雾电离源；扫描方式：多反应监测模式（Multiple Reaction Monitoring, MRM），当测定展青霉素时，采用负离子扫描（ES-）。当测定其他7种真菌毒素时，采用正离子扫描（ES+），8种物质母离子、子离子质谱信息见表2；电喷雾电压：-2500V、3500 V；离子源温度：350 ℃；雾化气：40 Arb；辅助气：10 Arb。表2 8种真菌毒素母离子、子离子质谱信息化合物名称　电离模式　母离子　子离子　碰撞能（V）　去簇电压（V）黄曲霉毒素B1　正　313.1　241.2*/269.2　29.47/30.15　161黄曲霉毒素B2　正　315.1　259.0*/287.1　28.55/25.05　173黄曲霉毒素G1　正　329.1　214.5*/243.0　31.37/25.56　166黄曲霉毒素G2　正　331.1　245.1*/313.1　28.84/22.82　183赭曲霉毒素A　正　402.1　167.0*/358.1　35.03/18.27　137T-2毒素　正　489.3　245.1*/327.1　26.23/22.61　189伏马毒素B2　正　706.3　336.6*/353.1　37.10/31.16　169展青霉素　负　153.0　109.1*/81.1　8.41/11.44　59注：*表示定量离子表。7.3.3  基质标准曲线的绘制选择与待测样品性质相同或者相似的空白样品按照7.1、7.2的方法进行处理，得到空白基质溶液。精密量取一定量的展青霉素标准中间液与混合标准中间液，用空白基质溶液逐级稀释成展青霉素质量浓度为0.050μg/mL、0.100 μg/mL、0.150 μg/mL、0.200 μg/mL、0.250 μg/mL、0.500 μg/mL，其他7种真菌毒素质量浓度为0.010 μg/mL、0.020 μg/mL、0.050 μg/mL、0.100 μg/mL、0.200μg/mL、0.500 μg/mL的基质匹配标准系列工作液。根据仪器性能和检测需要选择不少于5个浓度点，供液相色谱-三重四级杆质谱联用仪分析。分别以各待测组分定量离子的色谱图峰面积作纵坐标，以相应基质匹配标准系列工作液浓度作横坐标，绘制标准曲线。7.3.4  定性与定量7.3.4.1 保留时间被测组分色谱峰的保留时间应与相应标准品色谱峰保留时间接近，相对误差应当在±2.5 %之内。7.3.4.2 离子丰度比在相同实验条件下，如果检出样品中被测组分色谱峰的保留时间与相应标准品色谱峰保留时间符合7.3.4.1的要求，并且在扣除背景后的样品质谱图中，被测化合物所选定的两个子离子均出现，且在同一检测批次，同一化合物中，样品中被测化合物的子离子丰度比与质量浓度相当的基质标准溶液子离子丰度相比，其允许偏差不超过表3规定的范围，则可判定样品中存在被测化合物。表3 定性时离子丰度比的最大允许偏差离子丰度比　＞50　＞20~50　＞10~20　≤10允许偏差　±20　±25　±30　±507.3.4.3 定量定量采用外标法定量。7.4 空白实验除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行。8  结果计算试样中真菌毒素残留量按公式（1）计算。（1）式中：X-试样中待测组分的含量，mg/kg；c-从标准曲线上测得试液中待测组分的质量浓度，ng/mL；m-试样质量，g；V-试样提取液总体积，mL；1000-单位换算系数；注：计算结果保留三位有效数字。9  精密度在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不大于算数平均值的15%。10  其他8种真菌毒素标准溶液离子色谱图见附录A