范围:本文件规定了生牛乳中乳铁蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的液相色谱-串联质谱测定方法。 本文件适用于生牛乳中乳铁蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的测定; 主要技术内容:4　原理试样中的乳铁蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白经酶解作用水解成特征性肽段，以液相色谱-串联质谱法测定目标蛋白的特征性肽段，基质匹配标准曲线外标法定量，计算试样中乳铁蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的含量。5　试剂或材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯。5.1　试剂5.1.1水：GB/T 6682，一级水。5.1.2碳酸氢铵。5.1.3二硫苏糖醇。5.1.4碘代乙酰胺。5.1.5乙酸。5.1.6胰蛋白酶：序列分析纯，活力单位≥4 500 U/mg，或性能相当者。5.1.7甲酸：色谱纯。5.1.8乙腈：色谱纯。5.1.9鸡蛋蛋清粉：食品级。5.2　试剂配制5.2.1碳酸氢铵溶液（100 mmol/L）：称取0.79 g碳酸氢铵，用水溶解后稀释至100 mL。5.2.2二硫苏糖醇溶液（500 mmol/L）：称取0.771 g二硫苏糖醇，用碳酸氢铵溶液（100 mmol/L）溶解后定容至10 mL。5.2.3碘代乙酰胺溶液（500 mmol/L）：称取0.925 g碘代乙酰胺，用碳酸氢铵溶液（100 mmol/L）溶解后定容至10 mL。5.2.4乙酸溶液（1 %）：吸取0.1 mL乙酸，用水稀释并定容至10 mL。5.2.5胰蛋白酶溶液（100 μg/mL）：称取1 mg胰蛋白酶，用乙酸溶液（1 %）溶解后稀释至10 mL，现用现配。5.2.6甲酸溶液（0.1 %）：吸取1.0 mL甲酸，用水稀释并定容至1 000 mL。5.2.7甲酸乙腈溶液（0.1%）：吸取1.0 mL甲酸，加入乙腈稀释并定容至1 000 mL。5.2.8空白基质溶液：称取0.10 g鸡蛋蛋清粉，用水定容至50 mL备用。5.3　标准品5.3.1乳铁蛋白标准品（CAS号：146897-68-9）：纯度≥95%，铁含量≤35 mg/100g，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。5.3.2α-乳白蛋白标准品（CAS号：9051-29-0）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。5.3.3β-乳球蛋白标准品（CAS号：9045-23-2）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。5.4　标准溶液配制5.4.1乳铁蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白标准储备液（1 mg/mL）：分别称取10.0 mg乳铁蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白标准品，用水定容至10 mL。混匀，0~4 ℃下保存，可保存3个月。5.4.2混合标准中间液（200 μg/mL）：分别准确移取2.0 mL的乳铁蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白标准储备液于10 mL容量瓶中，用空白基质溶液稀释至10 mL，现用现配。5.4.3标准系列工作液：吸取适量的混合标准中间液，用空白基质溶液逐级稀释至1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、50.0 μg/mL、100.0 μg/mL和200.0 μg/mL标准系列工作液，现用现配。5.5　材料5.5.11.5 mL离心管：聚丙烯材质。5.5.250 mL离心管：聚丙烯材质。5.5.3水相微孔滤膜：0.22 μm，聚醚砜材质。6　仪器和设备6.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。6.2天平：感量0.01 g和0.01 mg。6.3冷冻离心机：转速≥10 000 r/min。6.4涡旋混合仪。6.5超声波仪。6.6恒温振荡箱或恒温振荡水浴锅