范围:本文件规定了焙烤食品中丙烯醛含量测定的荧光法快速测定的原理、试剂和材料、仪器设备、样品制备、试验步骤、试验数据处理、精密度和试验报告等。 本文件适用于焙烤食品中丙烯醛的测定，方法检出限为1.12 μg/kg，定量限为3.92 μg/kg; 主要技术内容:4　原理N-乙酸甲酯-4-巯基-1，8-萘酰亚胺中的巯基对萘酰亚胺荧光母核具有PET效应，其本身荧光十分微弱；而当丙烯醛存在的情况下，N-乙酸甲酯-4-巯基-1，8-萘酰亚胺的巯基与丙烯醛通过迈克尔加成反应形成加合产物，使得PET效应被抑制，加合物在波长380 nm发射光激发下产生强荧光，峰值在510 nm波长处，其荧光强度在固定条件下与待测样品中丙烯醛浓度成正比，使用带荧光检测器的酶标仪检测，外标法定量。荧光探针法测定丙烯醛的原理见图1。图1  荧光探针法测定丙烯醛的原理图5　试剂和材料5.1　试剂除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。4-溴-1，8-萘二甲酸酐（分析纯）。甘氨酸（分析纯）。三乙胺（分析纯）。乙醇（分析纯）。盐酸（分析纯）。对甲苯磺酸（分析纯）。甲醇（分析纯）。九水合硫化钠（分析纯）。二甲基亚砜（DMSO，分析纯）。柠檬酸（分析纯）。磷酸氢二钠（分析纯）。丙烯醛（分析纯）。5.2　荧光探针的制备将554 mg 4-溴-1，8-萘二甲酸酐和165 mg甘氨酸、252 mg三乙胺在80 ℃的乙醇回流磁力搅拌反应6 h，反应完成后冷却至室温，向反应液中加入2.5 mL 1M 盐酸溶液调节pH至白色沉淀析出，经抽滤得到的固体分别用10 mL水和乙醇进行洗涤，得到的白色固体即为N-乙酸基-4-溴-1，8-萘酰亚胺；室温下，将167 mg N-乙酸基-4-溴-1，8-萘酰亚胺和600 mg九水合硫化钠溶解于5 mL N，N-二甲基甲酰胺中搅拌反应24 h，反应结束后将反应液倒入20 mL水中，并用1M 盐酸水溶液调节pH至2，有黄色沉淀析出。经抽滤得到的固体用水洗涤五遍后，得到的黄色固体即为N-乙酸基-4-巯基-1，8-萘酰亚胺（Pr-ACR），冷冻干燥，置于-20 ℃冰箱中备用。5.3　试剂配制柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液 pH为2.2，1 mmol/L，15.198 g一水合柠檬酸和1.955 g十二水合磷酸氢二钠溶解于水中，再用250 mL容量瓶定容。探针母液：2.15 mg Pr-ACR溶于0.5 mL DMSO中，制成浓度为150 mmol/L探针母液，母液要现配现用。探针工作液：移取50 μL Pr-ACR母液加入到5 mL容量瓶中，用4.3.1的缓冲溶液定容到5 mL，工作液要现配现用。5.4　标准品丙烯醛标准品（C3H4O ,CAS号：107-02-8）：纯度大于 98.0%。5.5　标准溶液的配置用水配制成丙烯醛浓度为30 μmol/L的溶液，再用水稀释混匀得到一系列浓度的标准溶液（0 μmol/L、3 μmol/L、6 μmol/L、12 μmol/L、18 μmol/L、24 μmol/L、30μmol/L）。6　仪器设备6.1　酶标仪（带荧光检测器，Ex 250-600 nm，Em 280-600 nm)。6.2　96孔板（黑色）。6.3　粉碎机(细度 30-100目）。6.4　天平：感量0.00001 g。6.5　移液枪（1 μL-10 μL、10 μL-100 μL和100 μL-1000 μL）。6.6　常规玻璃仪器。6.7　离心机（12000转/分，14000×g)。7　试验步骤7.1　准曲线的绘制移取100 μL 4.3.3中的探针工作液到96孔板中，再加入50 μL 4.5中不同浓度的丙烯醛标准液，使丙烯醛浓度分别为0 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、6 μmol/L、8 μmol/L、10 μmol/L，摇匀，并置于25 ℃下反应90 min后，置于酶标仪中进行荧光检测，读取波长510 nm处的荧光强度值（激发波长为380 nm），其荧光发射光谱图见附录A。7.2　样品的制备将1 g 磨碎的食品粉末加入到15 mL离心管中，加入5 mL水，搅拌均匀并超声提取20 min，再用离心机在10 000 r/min的转速下离心20 min，收集上清液。离心管中的沉淀物质再用2 mL水按上述操作重复提取两次，合并3次提取得到的上清液，定容到10 mL，备用。7.3　样品的测定移取100 μL 4.3.3中的探针工作液到黑色96孔板中，再加入50 μL 6.2中的样品提取液，摇匀，置于25 ℃下反应90 min后，用酶标仪进行荧光检测，读取波长510 nm处的荧光强度值（激发波长为380 nm），每次处理重复3次。7.4　空白实验除不称取样品外，均按照上述测定条件和步骤进行。8　试验数据处理样品中丙烯醛的含量按以下公式计算：……………………………………（1）式中：X—— 样品中丙烯醛的含量，毫克/千克（mg/kg)；56.06 —— 丙烯醛的摩尔质量；C —— 样品液中丙烯醛的摩尔质量浓度，微摩/升（μmol/L)；V —— 被测样品的总体积，毫升（mL）；m —— 称取样品的质量，克（g）。计算结果以重复性条件下获得的3次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。9　精密度9.1　一般规定本文件的精密度按照GB/T 6379.2的规定确定，重复性和再现性的值以 95% 的可信度来计算。9.2　重复性在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10% 。9.3　再现性在再现性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10% 。10　试验报告试验报告至少应给出以下几个方面的内容：——试验对象；——所使用的标准；——所使用的方法；——结果；——观察到的异常现象；——试验日期。附录A（资料性）荧光发射光谱图