主要技术内容:多杀性巴氏杆菌的检测 PCR 法 1 范围 本文件规定了猪多杀性巴氏杆菌的PCR检测方法。 本方法适用于猪多杀性巴氏杆菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期 的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括 所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 NY/T 564-2016 猪巴氏杆菌病诊断技术 3 原理 根据多杀性巴氏杆菌的基因序列设计一对特异性引物，以多杀性巴氏杆菌的 DNA 核酸 为模板，扩增特异的目的 DNA 片段。扩增的 DNA 片段经琼脂糖凝胶电泳，根据 DNA 条带 的大小来判断结果。 4 试剂或材料 除非另有规定，所用试剂均为分析纯。 4.1 水：GB/T6682，一级。 4.2 5%绵羊鲜血平板 4.3 革兰氏染液 4.4 2×Taq Master Mix 4.5 DNA Marker DL 2000 4.6 琼脂糖 4.7 TAE缓冲液 4.8 4S Green Plus 无毒核酸染料T/SDAA 0045－2021 5 仪器设备 5.1 生物安全柜：配ULPA超高效空气过滤器。 5.2 高速冷冻离心机：转速不低于12000 rpm/min。 5.3 PCR仪：最大升降温速率为4℃/秒，温度范围4℃~99℃。 5.4 凝胶成像仪：图像分辨率不低于500万像素，灵敏性可检测出低于20pg EB染色的双链 DNA。 5.5 紫外透射仪：透射紫外光源波长为 302nm。 5.6 电泳仪，恒压输出范围：3～300V、恒流输出范围：1～400mA、恒功率输出范围：1～ 120W。 6 样品 按照NY/T 541 的规定采集、贮存样品。 7 试验步骤 7.1 细菌的分离及纯培养 7.1.1 在生物安全柜内，将无菌采取的患病动物心血用接种环直接在绵羊鲜血平板上划线接 种。对采集的肺脏、肝脏或脾脏，用酒精灯火焰烧红的刀片烧烙肺脏、肝脏或脾脏的表面， 用无菌手术剪刀在烧烙部位剪开一个小口。酒精灯火焰灼烧接种环，冷却后将接种环从病料 的小口处扎入肺脏等内部，挑取少量组织，在 5%绵羊鲜血平板上划线接种。接种后的平板 贴好标签后放入恒温箱，37℃培养 24h，观察菌落大小、形态、溶血状况等。 7.1.2 猪多杀巴氏杆菌的菌落为圆形、边缘整齐、表面光滑似粘液状、大小为 1mm~1.5mm 左右，菌落形态参见附录 A.1。 7.2 革兰氏染色与镜检 7.2.1 取洁净的载玻片，用接种环钩取一环无菌生理盐水在载玻片上涂布呈直径 1cm 大小的 水膜。挑取单个菌落均匀涂抹在水膜内，室温干燥、火焰固定。进行革兰氏染色。 7.2.2 滴加结晶紫染色液，染色 1min~2min，流水缓慢冲洗，干燥； 7.2.3 滴加革兰氏碘液，染色 1min~2min，流水缓慢冲洗，干燥 ； 7.2.4 滴加 95%的乙醇，脱色 10s~30s，流水缓慢冲洗，干燥；T/SDAA 0045－2021 7.2.5 滴加复染液，复染 1min，流水缓慢冲洗，自然干燥。 7.2.6 镜检 猪多杀巴氏杆菌为革兰氏染色阴性、短小杆菌或球杆菌，细菌形态参见附录 A.2。 7.3 PCR 检测 7.3.1 细菌基因组 DNA 模板的制备 按照 NY/T564-2016 中 4.4.4 中的规定制备。 7.3.2 PCR 扩增 7.3.2.1 引物 根据多杀巴氏杆菌 16S rRNA 基因序列（见附录 A.3），设计一对引物，商业合成，引 物序列见附录 B.1。 7.3.2.2 PCR 反应体系 PCR 反应体系为 25μL 体系，见附录 B.2。 7.3.2.3 PCR 反应条件 样品反应管以 2000 rpm/min 离心 1min，置于 PCR 扩增仪内进行扩增。PCR 反应条件为： 94℃预变性 5min，94℃变性 30 s，53℃退火 30s，72℃延伸 30s，扩增 32 个循环，72℃终延 伸 10min，结束反应。同时设置多杀巴氏杆菌阳性（标准株）和阴性（无菌水）对照。PCR 扩增产物用 1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，紫外透射仪或凝胶成像仪观察扩增 DNA 条带的大 小。7.4 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳 按 NY/T 564-2016 4.4.6 规定执行。 7.5 结果判定 7.5.1 试验成立的条件 参照 DL2000 DNA Marker 中 DNA 条带的大小，当阳性对照扩增出约 355bp 片段，阴性对照 未扩增出片段，检测结果成立，核酸电泳结果见附录 B.3。 7.5.2 阳性判定 符合 7.5.1 的条件下，被检样品扩增出约 355bp 的片段，则判定被检细菌为多杀性巴氏 杆菌。T/SDAA 0045－2021 7.4.5.3 阴性判定 符合 7.5.1 的条件下，被检样品未扩增出约 355bp 的片段，则判定被检细菌不是多杀性 巴氏杆菌