范围:本文件规定了创面修复材料体外评价的刺激物浓度确定试验、物理屏蔽细胞活力试验和物理屏蔽细胞迁移试验。 本文件适用于水凝胶或固态创面修复生物材料屏蔽保护创面细胞活力和迁移效果的评价; 主要技术内容:4　刺激物浓度确定试验4.1原理将刺激物溶解在培养基中，配成不同梯度已知浓度的样品，按照GB/T 16886.5测定刺激物不同浓度下的细胞毒性，确定刺激物存活率40％、50％和60％的浓度。4.2器具、试剂和耗材、细胞系、刺激物4.2.1　器具试验器具如下：a)二氧化碳细胞培养箱；b)恒温水浴摇床；c)高压蒸汽灭菌锅；d)倒置荧光显微镜；e)细胞计数仪；f)恒温水浴摇床；g)酶标仪；h)电子天平；i)液氮罐；j)冷冻离心机；k)96孔板；l)细胞培养瓶或细胞培养皿。4.2.2　试剂和耗材试验试剂和耗材如下：a)含10％新生胎牛血清DMEM低糖培养基（含10％FBS?DMEM低糖培养基）；b)二甲基亚砜（DMSO）；c)异丙醇；d)高密度聚乙烯。4.2.3　细胞系4.2.3.1试验可使用的细胞系如下：a)成纤维细胞；b)皮肤上皮细胞；c)食管上皮细胞；d)胃黏膜上皮细胞；e)肠黏膜上皮细胞。4.2.3.2对于用于不同部位的修复材料选择合适的细胞系，如用于皮肤的修复材料可用皮肤细胞，用于食管的材料可选择食管上皮细胞。4.2.4　刺激物试验可使用的刺激物如下：a)盐酸；b)胃蛋白酶；c)胰蛋白酶；d)过氧化氢；e)细菌内毒素；f)其他。4.3样品制备4.3.1　刺激物梯度溶液准确称取刺激物溶解在含10％FBS?DMEM低糖培养基中，配置成不同梯度浓度的刺激物，过滤除菌低温保存备用。根据样品现有的细胞毒性数据，配置10个不同梯度浓度的刺激物。4.3.2　阴性对照计算直径为1?cm的高密度聚乙烯双面的面积，按3?cm2/mL加入含10％FBS?DMEM低糖培养基，37?℃、120?r/min摇床中浸提24?h，取上清液使用。4.3.3　阳性对照取适量DMSO加入含10％FBS?DMEM低糖培养基内，制备10％DMSO溶液，37?℃、120?r/min摇床中震荡24?h。4.3.4　空白对照含10％FBS?DMEM低糖培养基，37?℃、120?r/min摇床中震荡24?h。4.4试验方法按照GB/T 16886.5—2017中附录C规定的MTT细胞毒性试验方法进行，处理条件、检测模型、观察时间按表1进行。试验设置空白对照组、阴性对照组、阳性对照组、刺激物组，每个试验组设置6个复孔。将复苏好的成纤维细胞传至两代以上呈对数生长期时，按照1×105个/mL密度制备细胞悬液，每孔加入100?μL细胞悬液，然后接种到96孔板内，放入二氧化碳细胞培养箱在37?℃下培养24?h，移去旧培养基，按照试验设置加入对应培养液，继续培养24?h后，在显微镜下观察每组细胞形态，弃去每组培养液后加入1?mg/mL?50?μL?MTT溶液，放入细胞培养箱中孵育3?h后弃去孵育液，加入100?μL异丙醇，用振荡器上振荡使蓝紫色结晶充分溶解混匀，在酶标仪上检测570?nm和650?nm波长的吸光度值并按照式（1）计算细胞存活率。表1 细胞毒性试验()式中：P1——细胞相对存活率，％；A570?nm——阴性对照组在570?nm处的平均吸光度；A650?nm——阴性对照组在650?nm处的平均吸光度；B570?nm——阳性对照组在570?nm处的平均吸光度；B650?nm——阳性对照组在650?nm处的平均吸光度。4.5试验用刺激物浓度的确定根据细胞毒性试验结果，做刺激物浓度和细胞毒性关系曲线，选择细胞毒性存活率40％、50％、60％的3个浓度用于物理屏蔽细胞活力和物理屏蔽细胞迁移试验。若试验结果的细胞毒性存活率未能达到以上要求，宜进一步增加浓度或降低浓度重新进行细胞毒性试验。5　物理屏蔽细胞活力试验5.1原理采用Transwell细胞培养技术评价创面修复再生材料对胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶、过氧化氢、细菌内毒素等刺激因子屏障作用。物理屏蔽保护试验模式如图1所示。在有保护材料屏蔽的情况下可以避免刺激因子对细胞的刺激和毒性作用，细胞可以生长良好，而在没有保护的情况下细胞生长被抑制或细胞死亡。a）加入材料                          b）未加材料图1　材料屏蔽保护试验模型示意图5.2器具、试剂和耗材、细胞系5.2.1　器具试验器具如下：a)二氧化碳细胞培养箱；b)恒温水浴摇床；c)高压蒸汽灭菌锅；d)倒置荧光显微镜；e)细胞计数仪；f)恒温水浴摇床；g)酶标仪；h)电子天平；i)液氮罐；j)冷冻离心机；k)24孔板；l)Transwell孔板；m)96孔板。5.2.2　试剂和耗材试验试剂和耗材如下：a)含10％新生胎牛血清DMEM低糖培养基（含10％FBS?DMEM低糖培养基）；b)CCK-8试剂。5.2.3　细胞系同4.2.3。5.3刺激物溶液制备按4.5确定的浓度，按4.3.1配制3个浓度的刺激物溶液。5.4试验方法按照表2规定将处于对数生长期的细胞按照1×105个/mL的细胞密度铺于24孔板内，每孔加入1?mL，3个复孔，试验组的Transwell孔板中加入0.2?mL保护胶使其厚度为1.0?mm～1.5?mm，空白对照组不做处理，分别向每组中加入3个不同浓度的刺激物观察24?h、48?h、72?h细胞增殖情况，酶标仪下检测450?nm的吸光度，按照式（2）计算细胞存活率，评估创面修复材料屏蔽保护细胞活力作用。表2　物理屏蔽细胞活力试验()式中：P1——细胞存活率，％；A450?nm——试验组在450?nm处的平均吸光度；B450?nm——空白对照组在450?nm处的平均吸光度。5.5结果分析采用统计学方法评价试验结果，并对空白对照组、试验组结果进行综合分析评估。经统计学分析试验组和空白对照组比较p＜0.05则认为该材料具有屏蔽保护细胞活力的作用，否则材料没有屏蔽保护细胞活力的作用。6　物理屏蔽细胞迁移试验6.1原理采用Transwell细胞培养技术评价创面修复再生材料对胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶、过氧化氢、细菌内毒素等刺激因子屏障作用。物理屏蔽保护试验模式如图1所示。在有保护材料屏蔽的情况下可以避免刺激因子对细胞的刺激和毒性作用，细胞可以迁移，而在没有保护的情况下细胞迁移被抑制。6.2器具、试剂和耗材、细胞系6.2.1　器具试验器具如下：a)二氧化碳细胞培养箱；b)恒温水浴摇床；c)高压蒸汽灭菌锅；d)倒置荧光显微镜；e)细胞计数仪；f)恒温水浴锅；g)恒温水浴摇床；h)酶标仪；i)电子天平；j)液氮罐；k)24孔板；l)Transwell孔板；m)细胞培养瓶；n)Image J图像处理软件。6.2.2　试剂和耗材含10％新生胎牛血清DMEM低糖培养基（含10％FBS?DMEM低糖培养基）。6.2.3　细胞系同4.2.3。6.3刺激物溶液制备同5.3。6.4试验方法按照表3规定将处于对数生长期的细胞按照1105个/mL的细胞密度铺于24孔板内，每孔加入1?mL，3个复孔，24?h后将一灭菌直尺放置于孔板孔上方，用1?mL枪垂直于孔板和直尺间划一道横线，在10×显微镜下观察。样品组的Transwell孔板中加入0.2?mL的保护胶使其厚度为1.0?mm～1.5?mm，空白对照组不做处理，分别在每组中加入3个不同浓度的刺激物。拍摄0?h、以及培养12?h、24?h时的细胞图片，应用Image J按式（3）计算不同时间的细胞迁移率，评估生物材料作用后的对细胞迁移的影响。表3　物理屏蔽细胞迁移试验()式中：P2——细胞迁移率，％；S0——细胞划痕后0?h细胞未覆盖的区域面积；S12——细胞划痕后12?h细胞未覆盖的区域面积；S24——细胞划痕后24?h细胞未覆盖的区域面积。6.5结果分析采用统计学方法评价试验结果，并对空白对照组、试验组结果进行综合分析评估。经统计学分析试验组和空白对照组比较p＜0.05则认为该材料具有屏蔽保护促进细胞迁移的作用，否则材料没有屏蔽保护促进细胞迁移的作用