主要技术内容:1  范围本标准适用于葡萄中黑曲霉的测定。本标准规定了葡萄中黑曲霉的检验方法。本文件适用于新疆地区鲜葡萄、葡萄干中黑曲霉的检测。2  规范性引用文件本文件中引用的文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用规定的一级水。3  术语和定义3.1  鲜葡萄 fresh grapes选用新鲜、洁净，经过一定加工或保鲜处理的葡萄。3.2  葡萄干 Raisins经自然风干或人工加热等方式使葡萄果实脱水而成。3.3  黑曲霉Aspergillus niger黑曲霉属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科、曲霉属真菌中的常见种。在高温、高湿环境下易大量生长繁殖，多生于多汁的果实上，引起腐烂变质。4  原理被感染葡萄中的黑曲霉可在马铃薯葡萄糖琼脂上于28℃条件下培养5d，检测霉菌，从中分离黑曲霉，通过生化鉴定确定黑曲霉菌并计数，算出每毫升检验中黑曲霉菌数。5  培养基与试剂5.1 培养基5.1.1马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）。5.1.2 2%淀粉查氏培养基。5.2  试剂5.2.1 无菌生理盐水。5.2.2 I2-Ki试剂(花粉活力染色液)。6  标准菌株6.1黑曲霉标准菌株7  仪器和设备7.1培养箱：28℃士1℃。7.2拍击式均质器及均质袋。电子天平：感量 0.1 g。7.3无菌锥形瓶：容量 500 mL。7.4无菌吸管：1 mL(具 0.01 mL刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)。7.5无菌试管：18 mmx180 mm。7.6旋涡混合器。7.7无菌平皿:直径 90 mm。7.8恒温水浴箱:46 ℃士1℃。7.9显微镜：10倍~100倍。7.10微量移液器及枪头：1.0 mL。7.11郝氏计测玻片：具有标准计测室的特制玻片。盖玻片。7.12测微器:具标准刻度的玻片。7.13电子天平：感量0.01 g。7.14振荡器8  检测程序见图1。图1黑曲霉菌数测定检验程序8.1  检测步骤：8.1.1称取25g样品置盛有225mL生理盐水的无菌均质袋内，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。8.1.2 取1 mL 1:10 样品匀液注入含有9mL无菌稀释液的试管中，另换一支1mL无菌吸管反复吹吸，或在旋涡混合器上混匀，此液为 1∶100 的样品匀液。8.1.3 按 5.1.3 操作，制备 10 倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1支1 mL 无菌吸管。8.1.4 根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液,在进行10 倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1mI无菌稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。8.1.5 及时将15mL～20mL冷却至46℃的马铃薯葡萄糖琼脂(可放置干46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。置水平台面待培养基完全凝固。8.2 培养琼脂凝固后，正置平板，置28℃+1℃培养箱中培养,观察并记录培养至第5d的结果。（注：若污染程度过高，可在第3d开始进行观察。）9  生化实验自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落进行鉴定试验。9.1 黑曲霉菌落形态观察黑曲霉的菌落蔓延迅速，但生长稍局限，菌丝为白色，之后变成鲜黄色直至黑色厚绒状，背面无色或中央略带黄褐色，顶部形成球形顶囊。其分生孢子头球形，直径700～800μm，褐黑色。9.2 淀粉分解实验淀粉分解实验：用2%淀粉查氏培养基进行。用接种环刮取纯化的黑曲霉孢子一环于装有100mL无菌生理盐水和玻璃珠的锥形瓶中，振荡。取1mL孢子悬液注入2%淀粉查氏培养基平板中涂布，37°C倒置培养2天，向培养基中滴入I2-Ki试剂(花粉活力染色液)，用直尺测量菌落产生的透明圈大小并记录。9.3 产柠檬酸鉴定用无菌接种环轻轻刮下典型或可疑菌的菌丝及孢子于无菌水中制成菌悬液，装在有PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）培养基的锥形瓶中摇匀。置于振荡器中，35°C，200r/min培养2天。取5mL发酵液于试管中，滴入饱和CaCO3溶液，有白色沉淀则证明产生柠檬酸,黑曲霉产生柠檬酸。10  菌落计数依据GB 4789.15-2016食品安全国家标准 霉菌和酵母计数，选择有典型的黑曲霉菌菌落的平板，以菌落单位（colony-forming units，CFU）表示。选取菌落在10CFU～150CFU的平板，根据菌落形态计数黑曲霉，蔓延生长覆盖整个平板的可记录为菌落蔓延。11  结果与报告11.1 结果11.1.1 计算同一稀释度的两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数。11.1.2 若有两个稀释度平板上菌落数均在10CFU～150 CFU之间，则按照GB 4789.2的相应规定进行计算。11.1.3 若所有平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。11.1.4 若所有平板上菌落数均小干10CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。11.1.5 若所有稀释度的平板菌落数均不在10CFU～150CFU之间，其中一部分小干10CFU或大干150CFU时，则以最接近10CFU或150CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。11.2  报告11.2.1 菌落数按“四舍五入”原则修约。菌落数在10以内时，采用一位有效数字报告；菌落数在10～100之间时，采用两位有效数字报告。11.2.2 菌落数大于或等于100时，前第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数来表示结果；也可用10的指数形式来表示，此时也按"四舍五人"原则修约，采用两位有效数字。11.2.3 若空白对照平板上有菌落出现，则此次检测结果无效。11.2.4 称重取样以CFU/g为单位报告